Constructing a single-objective oblique plane microscope (OPM) for fast, multi-colour, high-resolution volumetric fluorescence imaging

Dit artikel biedt een gedetailleerd stappenplan voor het bouwen en karakteriseren van een enkel-objectief oblique plane microscoop (OPM) met commercieel verkrijgbare onderdelen, waarmee onderzoekers snelle, hoogresolutie 3D-fluorescentiebeeldvorming kunnen realiseren zonder de complexe uitlijningseisen van traditionele lichtsheet-microscopie.

De kern

Stel je voor dat je een heel klein, levend dier wilt bekijken, zoals een cel in je lichaam. Normaal gesproken zou je een hele dikke lantaarn op de cel schijnen om hem te zien. Het probleem is dat het licht dan ook door de rest van de cel gaat, waardoor het beeld wazig wordt en de cel zelf beschadigd raakt door het felle licht.

De wetenschappers in dit artikel hebben een slimme oplossing bedacht: Oblique Plane Microscopy (OPM).

Hier is hoe ze dat doen, vertaald naar alledaagse taal:

1. Het probleem met de oude manier

Stel je voor dat je een boek wilt lezen, maar je moet het hele huis verlichten om één pagina te zien. Dat is niet alleen zonde van het licht, maar je kunt ook niet snel bladeren zonder het hele huis te verplaatsen.
Bij de oude microscopen moest je de cel zelf verplaatsen (schuiven) om een nieuw laagje te bekijken. Dat is traag en trilt de cel, waardoor het beeld wazig wordt.

2. De oplossing: Een "laser-zonnescherm"

In plaats van een hele lantaarn, gebruiken deze wetenschappers een heel dunne laserstraal die eruit ziet als een zonnescherm. Ze schijnen dit scherm schuin door de cel.

• De truc: Ze verlichten alleen het dunne laagje waar ze naar kijken. De rest van de cel blijft in het donker.
• Het voordeel: De cel wordt niet beschadigd door overmatig licht, en het beeld is super scherp omdat er geen "wazige achtergrond" is.

3. De grote uitdaging: De "Scheve Spiegel"

Hier wordt het technisch. Omdat de laser schuin door de cel gaat, is het beeld dat je terugkrijgt ook scheef. Het is alsof je door een raam kijkt dat schuin staat; alles ziet eruit alsof het is gedraaid.
Om dit recht te maken, hebben ze een ingenieuze constructie gebouwd met een verre-focussysteem.

• De analogie: Stel je voor dat je een foto van een scheefstaand gebouw maakt. Normaal zou je de camera moeten kantelen, maar dan wordt de foto wazig. In plaats daarvan gebruiken ze een reeks spiegels en lenzen die de "scheve foto" in de lucht "vangen" en hem digitaal en optisch weer rechtzetten voordat hij op de camera terechtkomt.
• Het resultaat: Je kunt de cel van bovenaf bekijken (met één grote lens), maar het systeem corrigeert de hoek zo, alsof je recht naar beneden kijkt.

4. Waarom is dit zo speciaal?

Vroeger was dit soort microscopen alleen voor dure laboratoria met super-experts die jaren nodig hadden om het op te bouwen. Het was als het bouwen van een Formule 1-auto zonder handleiding.
Dit artikel is de handleiding.
De auteurs zeggen: "Hier is precies hoe je dit bouwt, stuk voor stuk, met onderdelen die je in de winkel kunt kopen." Ze geven een stap-voor-stap gids, inclusief hoe je de lasers moet uitlijnen (alsof je een laserpointer door twee kleine gaatjes moet schieten zonder dat hij de rand raakt).

5. Wat kun je ermee doen?

Met deze nieuwe, goedkopere en snellere microscoop kunnen biologen nu:

• Snel filmen: Ze kunnen zien hoe cellen zich bewegen, alsof je een video maakt in plaats van een foto.
• Diep kijken: Ze kunnen door dikkere weefsels kijken zonder dat het beeld wazig wordt.
• Kleuren: Ze kunnen meerdere kleuren tegelijk gebruiken om verschillende onderdelen van de cel (zoals het skelet of het DNA) in verschillende kleuren te zien.

Kortom:
Deze wetenschappers hebben een ingewikkeld, duur stukje technologie (een microscoop die cellen in 3D filmt) omgebouwd tot een "doe-het-zelf-kit" voor biologen. Ze hebben de "geheime recepten" gedeeld zodat elke universiteit nu een supersnelle, scherpe camera voor levende cellen kan bouwen, zonder dat ze een team van ingenieurs nodig hebben. Het is alsof ze de blauwdruk hebben vrijgegeven om zelf een Ferrari te bouwen in je garage.

Technische samenvatting

Titel: Constructie van een enkel-objectief schuine vlakken microscoop (OPM) voor snelle, meerkleurige, hoog-resolutie volumetrische fluorescentie-imaging

1. Het Probleem

Fluorescentiemicroscopie is essentieel voor biologisch onderzoek, maar conventionele technieken hebben beperkingen. Wide-field microscopie leidt tot onscherpe achtergronden en fototoxiciteit door het verlichten van het hele monster. Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) lost dit op door alleen een dun lichtvlak te verlichten, maar conventionele LSFM-systemen vereisen twee orthogonaal geplande objectieven. Dit creëert aanzienlijke uitdagingen:

• Monstervoorbereiding: Specifieke houder (zoals gel-cilinders) is vaak nodig, wat incompatibel is met standaard biologische containers (Petrischalen, well-plates).
• Ruimtelijke beperkingen: Bij hoge numerieke apertuur (NA) objectieven is er vaak ruimtegebrek tussen de lenzen.
• Mechanische stabiliteit: Het fysiek verplaatsen van het monster of de lenzen voor volumetrische imaging vertraagt de opname en introduceert trillingen.
• Toegankelijkheid: Bestaande OPM-oplossingen (Oblique Plane Microscopy) zijn complex, vereisen geavanceerde optische uitlijning en zijn niet commercieel beschikbaar als kant-en-klaar product, waardoor ze ontoegankelijk zijn voor de meeste biologielaboratoria.

2. Methodologie

Het artikel presenteert een uitgebreid protocol voor het bouwen van een compacte, enkel-objectief OPM (Single-Objective OPM) met behulp van commercieel verkrijgbare componenten. Het systeem gebruikt één hoog-NA objectief (O1) zowel voor verlichting als voor het verzamelen van fluorescentie.

Kerncomponenten en ontwerp:

• Optische lay-out: Het systeem bestaat uit twee lagen. De onderste laag bevat het excitatiepad (lasers, cilindrische lenzen, galvo-spiegel) en de bovenste laag het emissiepad.
• Remote-Refocusing Systeem (RFS): Een cruciaal onderdeel is het RFS, dat een onvervormd beeld van het schuine vlak projecteert op een camera zonder het monster fysiek te verplaatsen. Dit wordt bereikt door een secundair objectief (O2) en een tertiair, schuin geplaatst objectief (O3, een glas-tipped objectief).
• Verlichting: Er wordt gebruik gemaakt van een Gaussisch lichtblad (of optioneel Bessel/Airy), gegenereerd door een cilindrische lens. Een 1D galvo-spiegel scant het lichtblad door het monster voor snelle volumetrische imaging.
• Berekeningen: Het protocol biedt formules voor het berekenen van de diepte van het veld (DOF), Rayleigh-lengte, en de vereiste vergrotingen van de lenzen (TL1, TL2, TL3) om aberraties te minimaliseren en de numerieke apertuur optimaal te benutten.
• Uitlijning: Een stap-voor-stap uitlijnprocedure wordt beschreven, gebaseerd op de "twee-iris-techniek" om de optische as te definiëren. Dit omvat het uitlijnen van de referentiepad, het excitatiepad, het emissiepad en de specifieke uitlijning van het RFS in zowel rechte als schuine configuraties.

3. Belangrijkste Bijdragen

• Gedetailleerd Bouwprotocol: Voor het eerst biedt dit artikel een complete, stap-voor-stap handleiding voor het assembleren van een OPM-systeem, inclusief de complexe RFS-module, met gebruik van standaard optische componenten.
• Design Tool: De auteurs bieden een Excel-bestand ("OPM_Easy2Use") aan om onderzoekers te helpen hun eigen optische parameters te berekenen en componenten te selecteren op basis van hun specifieke behoeften.
• Democratisering van de Technologie: Door de complexiteit van de uitlijning te reduceren tot een gestructureerd protocol, maken ze deze geavanceerde imaging-techniek toegankelijk voor niet-specialisten in de optica.
• Multi-kleur en Snelheid: Het systeem is ontworpen voor snelle, meerkleurige volumetrische imaging met minimale fototoxiciteit, ideaal voor levende cellen.

4. Resultaten

Het geconstrueerde systeem werd getest en gekarakteriseerd met succes:

• Resolutie: Het systeem bereikte een laterale (xy) resolutie van ongeveer 374 nm en een axiale (z) resolutie van 660 nm, gemeten aan de hand van 100 nm fluorescente microsferen. Dit benadert de diffractielimiet.
• Volumetrische Imaging: Het systeem kon snelle 3D-scans uitvoeren, beperkt door het frame-rate van de camera, zonder mechanische beweging van het monster.
• Biologische Toepassingen:
  • Cardiomyocyten: Hoog-resolutie 3D-reconstructies van volwassen rat-ventrikelcardiomyocyten, waarbij de myofibrillaire architectuur en membraanstructuren duidelijk zichtbaar waren.
  • Diatomeeën: Imaging van Coscinodiscus radiatus, waarbij de complexe 3D-intracellulaire architectuur binnen de stijve silica-frustules werd opgelost.
• Meerkleurigheid: Het systeem demonstreerde succesvolle twee-kleur imaging (bijv. WGA-Alexa Fluor 488 en CellMask Deep Red) zonder kruisinterferentie.

5. Betekenis

Deze bijdrage is van groot belang voor de levenswetenschappen omdat het een technische barrière wegneemt. OPM biedt unieke voordelen ten opzichte van conventionele LSFM:

• Compatibiliteit: Het werkt met standaard monsters en containers (Petrischalen, well-plates), wat het ideaal maakt voor high-throughput screening en langdurige live-cell imaging.
• Stabiliteit en Snelheid: Door het ontbreken van mechanische verplaatsing van het monster tijdens de scan, wordt mechanische drift geminimaliseerd, wat leidt tot scherpere beelden en hogere tijdsresolutie.
• Toekomstperspectief: Het protocol stelt onderzoekers in staat om de spatiotemporale organisatie van biomoleculen in 3D te visualiseren met hoge resolutie. Bovendien kunnen de hier beschreven principes en technieken worden toegepast op andere Light-SFM-methoden die Remote-Refocusing Systemen gebruiken.

Kortom, dit artikel transformeert OPM van een niche-techniek voor optische specialisten naar een praktische, reproduceerbare methode voor een breed scala aan biologische toepassingen.