3D-MINSTED nanoscopy and protein tracking in densely labelled living cells

Deze studie introduceert een 3D-MINSTED nanoscopie-techniek die het mogelijk maakt om individuele eiwitten, zoals kinesine-1, in levende cellen met een localisatieprecisie van minder dan 1 nm te volgen, zelfs bij hoge concentraties en in dichte omgevingen.

De kern

De Super-Spy Camera die Moleculen in 3D Kan Volgen

Stel je voor dat je in een enorm drukke, donkere discotheek staat. Je wilt één specifieke danser (een eiwit) volgen die over de dansvloer loopt. Het probleem? Er zijn duizenden andere mensen in dezelfde kleding, het is er donker, en je kunt ze allemaal niet goed zien. Normale camera's zouden hier vastlopen; ze zouden een wazige massa zien.

Dit is precies het probleem dat wetenschappers hebben bij het bestuderen van levende cellen. Cellen zijn drukke plaatsen vol met duizenden eiwitten die bewegen. Tot nu toe was het bijna onmogelijk om één enkel eiwit in 3D te volgen in zo'n drukke omgeving zonder dat het beeld wazig werd.

Maar in dit nieuwe onderzoek hebben de wetenschappers een revolutionaire nieuwe camera ontwikkeld: 3D-MINSTED.

Hoe werkt deze "Super-Spy Camera"?

Om het te begrijpen, gebruiken we een paar creatieve vergelijkingen:

1. De Varkensstaart en de Scherpe Lantaarn
Stel je voor dat je een danser wilt vinden in het donker.

• De oude methode (MINFLUX): Je gebruikt een lantaarn met een gat in het midden (een vorm als een donut of een varkensstaart). Je draait deze lantaarn rond de danser. Omdat het licht in het gat zwak is, licht de danser alleen op als hij in het donkere gat zit. Maar in een drukke discotheek (een cel) licht ook de rest van de menigte op door het randje van de lantaarn, waardoor het beeld wazig wordt.
• De nieuwe methode (3D-MINSTED): Hier gebruiken ze een slimme truc. Ze hebben een heel felle, gerichte lantaarn (de excitatie) én een tweede lantaarn die er precies tegenaan schijnt, maar dan in de vorm van een donut (de STED-straal). Deze tweede straal werkt als een "licht-uit-knop". Hij dooft het licht van iedereen, behalve voor de persoon die precies in het donkere gat zit.

Het resultaat? Het is alsof je in de drukke discotheek een onzichtbare, perfecte cirkel trekt rondom één danser. Iedereen buiten die cirkel wordt direct "uitgeschakeld" (niet zichtbaar). Alleen die ene danser in het midden blijft oplichten. Hierdoor kun je die ene persoon volgen, zelfs als er duizenden anderen omheen dansen.

2. De 3D-Trap
Vroeger konden ze alleen in platte beelden (2D) kijken, alsof je een dansvloer van bovenaf ziet. Maar dansers bewegen ook op en neer.
Deze nieuwe camera heeft een extra dimensie toegevoegd. Het is alsof ze niet alleen rondom de danser cirkelen, maar ook boven en onder hem schijnen. Ze kunnen nu de danser volgen terwijl hij over de vloer loopt, maar ook als hij een trap op- of afstapt. Ze kunnen zijn positie bepalen met een precisie van minder dan 1 nanometer. Dat is zo nauwkeurig dat je de breedte van een mensenhaar (die ongeveer 80.000 nanometer is) zou kunnen meten met een foutmarge van minder dan één haarbreedte!

Wat hebben ze ontdekt?

De wetenschappers hebben deze camera getest op een soort moleculair transporteur genaamd kinesine. Dit zijn kleine motor-eiwitten die vracht door je cellen dragen, net als kleine vrachtwagens die over sporen (microtubuli) rijden.

• In een vastgebonden cel: Ze zagen de motor-eiwitten stappen van precies 16 nanometer. Dit bevestigde wat ze al vermoedden, maar nu in 3D en met veel meer detail.
• In een levende cel: Dit was de echte uitdaging. In een levende cel is het chaotischer dan in een vastgebonden cel. Maar dankzij hun "licht-uit-knop" (de STED-straal) konden ze de motor-eiwitten volgen, zelfs toen er honderden andere eiwitten in de buurt waren. Ze zagen de motor-eiwitten hun 16-nanometer stappen zetten, terwijl ze door de cel reisden.

Waarom is dit zo belangrijk?

Stel je voor dat je vroeger alleen kon kijken naar een auto in een leeg veld. Nu kun je eindelijk kijken naar een auto die door de drukste stad ter wereld rijdt, op een moment dat er honderden andere auto's om je heen zijn, en je kunt precies zien hoe de wielen draaien.

Dit betekent dat we nu voor het eerst kunnen zien hoe eiwitten werken in hun natuurlijke, drukke omgeving. We kunnen zien hoe ze zich bewegen, hoe ze veranderen van vorm en hoe ze samenwerken, zonder dat we de cel hoeven te doden of te vervormen.

Kortom: Deze nieuwe techniek is als het vinden van de naald in de hooiberg, terwijl je de hooiberg in één keer kunt zien, en je de naald kunt volgen terwijl hij door de hooiberg rent. Het opent de deur naar een compleet nieuw begrip van hoe het leven op microscopisch niveau werkt.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Het bestuderen van de bewegingen en conformatieveranderingen van eiwitten in levende cellen is cruciaal voor het begrijpen van hun functie. Hoewel de recente nanoscopiemethode MINFLUX uitstekende prestaties levert bij het lokaliseren van enkele fluoroforen met nanometerprecisie, heeft deze methode ernstige beperkingen in dichte, levende cellen:

1. Achtergrondruis: MINFLUX maakt gebruik van een donut-vormige excitatiestraal met een intensiteitsminimum. Door diffractiewetten beslaat deze straal een veel groter volume dan een standaard gefocuste straal en genereert meer onspecifieke achtergrondfluorescentie.
2. Dichtheidslimiet: In omgevingen met veel gelabelde eiwitten (zoals in levende cellen) overschrijdt de fluorescentie van naburige fluoroforen vaak die van het te volgen molecuul. Dit maakt tracking in dichte omgevingen tot nu toe onmogelijk of zeer moeilijk, omdat MINFLUX doorgaans vereist dat er slechts één fluorofoor actief is binnen het samplingvolume.
3. 3D-tracking: Bestaande MINSTED-implementaties waren beperkt tot 2D of vaste cellen. Er was behoefte aan een methode voor 3D-tracking in levende cellen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Methodologie: 3D-MINSTED

De auteurs introduceerden een nieuwe setup voor 3D-MINSTED (MINimal photon fluxes for STimulated Emission Depletion), die de conceptuele voordelen van MINSTED combineert met 3D-lokalisatie.

• Principe: In tegenstelling tot MINFLUX (dat een excitatieminimum gebruikt), gebruikt MINSTED een regulier gepulseerde excitatiestraal die overlapt met een STED-straal (Stimulated Emission Depletion) met een donut-vorm. De STED-straal onderdrukt fluorescentie over het hele excitatievolume, behalve in het centrum van de donut (het intensiteitsminimum). Dit creëert een effectief puntverspreidingsfunctie (E-PSF) die veel kleiner is dan de diffractielimiet.
• 3D-Implementatie:
  • Laterale (x,y) lokalisatie: Een STED-straal (STED-XY) wordt omgezet in een 2D-donut met een vortex-fasplaat. Deze stralen worden rond de geschatte positie van het fluorofoor bewogen in een cirkelvormig patroon.
  • Axiale (z) lokalisatie: Twee extra STED-stralen (STED Z1 en Z2) worden gebruikt om boven en onder het vlak te bemonsteren. Met behulp van een ruimtelijke lichtmodulator (SLM) worden top-hat faseprofielen en defocus toegepast om 3D-donuts te creëren.
  • Tijdschakeling: De excitatie- en STED-pulsen worden interlaced (tijdsgewijs verweven) met verschillende herhalingsfrequenties (30 MHz voor excitatie, 10 MHz voor STED) om de positie in x, y en z onafhankelijk te bepalen.
• Achtergrondonderdrukking: De unieke kracht van deze opstelling is dat de STED-straal de fluorescentie van het gewenste label "uitkiert" uit de omgeving. Hierdoor kan de methode werken bij concentraties van gelabelde eiwitten die ongeveer 20 keer hoger zijn dan wat mogelijk is met commerciële MINFLUX-systemen, zonder dat de achtergrondruis de meting onbruikbaar maakt.

Belangrijkste Bijdragen

1. Ontwikkeling van een 3D-MINSTED-opstelling: De eerste demonstratie van 3D-tracking van enkele fluoroforen met een lokalisatieprecisie van < 1 nm.
2. Werken in dichte omgevingen: Het aantonen dat 3D-MINSTED effectief is in "crowded" levende cellen, waar traditionele super-resolutiemethoden falen door te veel achtergrondruis.
3. Hoge doorvoer: Door de mogelijkheid om in dichte labels te werken, neemt het aantal succesvolle metingen per tijdseenheid aanzienlijk toe, wat de toepasbaarheid van single-molecule tracking in levende systemen drastisch verbetert.

Resultaten

De methode werd getest op drie niveaus:

1. DNA-Origami (Validatie):

   • 3x3 DNA-origami-roosters werden gebruikt om de resolutie te testen.
   • De methode haalde een lokalisatieprecisie van < 1 nm in alle richtingen (x, y, z) bij voldoende fotonen.
   • De gemeten roosterafstanden (10,6 nm en 9,6 nm) kwamen overeen met de verwachte waarden, wat aantoont dat de methode structuren van < 10 nm kan onderscheiden, ongeacht hun oriëntatie.

2. Tracking in Vaste Cellen:

   • Het motor-eiwit kinesine-1 werd getrackt in gefixeerde U-2 OS-cellen.
   • De methode registreerde de "hand-over-hand" loopbeweging van kinesine langs microtubuli.
   • De gemiddelde stapgrootte was 16,7 ± 5,8 nm, wat overeenkomt met de verwachte stapgrootte van kinesine en eerdere 2D-metingen.

3. Tracking in Levende Cellen (Kernresultaat):

   • Kinesine werd getrackt in levende U-2 OS-cellen met een hoge dichtheid aan gelabelde eiwitten (meer dan één fluorofoor per diffractie-limiet volume).
   • Ondanks de hoge achtergrond en dichtheid werden > 10.000 tracks succesvol geregistreerd.
   • De gemiddelde stapgrootte was 16,7 ± 6,6 nm.
   • Het Signaal-tot-Achtergrond Ratio (SBR) bleef hoog (mediaan 10,8), zelfs in deze dichte omgevingen, dankzij de effectieve achtergrondonderdrukking van de STED-straal.
   • De temporele resolutie bedroeg ongeveer 2,4 ms.

Significantie

Deze studie markeert een doorbraak in de super-resolutiemicroscopie:

• Overcoming the "Crowding" Barrier: Het is de eerste keer dat single-molecule tracking in 3D succesvol wordt uitgevoerd in levende cellen met een hoge dichtheid aan gelabelde eiwitten. Dit opent de deur voor het bestuderen van eiwitdynamica in hun natuurlijke, dichte omgeving zonder dat de cellen extreem verdund moeten worden (wat de fysiologie kan verstoren).
• Unieke Capabiliteit: De combinatie van nanometer-precisie (<1 nm) en milliseconden-temporele resolutie in 3D, gecombineerd met de robustheid tegen achtergrondruis, maakt 3D-MINSTED superieur aan bestaande methoden zoals 3D-MINFLUX voor toepassingen in levende cellen.
• Toekomstperspectief: De techniek maakt routinematig onderzoek naar eiwitdynamica mogelijk in scenario's die voorheen onuitvoerbaar waren, zoals het volgen van moleculaire machines in het cytoplasma of langs membranen in een volledig gelabelde cel.