HtPIP: High-Throughput Phage Isolation Platform increases diversity and reduces isolation time using multiple bacteria

De auteurs presenteren HtPIP, een hoogdoorvoerkplatform dat gebruikmaakt van 0,2-micron filterplaten om in één keer diverse bacteriële gastheren te testen, waardoor de isolatietijd en -kosten worden verlaagd en een rijkere diversiteit aan nieuwe DNA- en RNA-fagen wordt ontdekt in vergelijking met traditionele methoden.

De kern

HtPIP: Een "Phage-Visnet" voor de Micro-Universum

Stel je voor dat bacteriën de bewoners zijn van een enorme, onbekende stad. En virusjes die bacteriën aanvallen, noemen we fagen (of bacteriofagen). Deze fagen zijn overal: in de grond, in het riool, in de oceaan. Ze zijn als de "politie" van de microscopische wereld; ze jagen op specifieke bacteriën en kunnen ze vernietigen of hun DNA herschrijven.

Het probleem? We kennen maar een heel klein deel van deze fagen. Voor de meeste bacteriën hebben we nog geen "politieagent" gevonden. En als we er eentje zoeken, is het vaak als een naald in een hooiberg zoeken: het kost veel tijd, geld en moeite.

In dit onderzoek hebben wetenschappers van Sandia National Laboratories een slimme nieuwe uitvinding bedacht: HtPIP. Laten we uitleggen hoe dit werkt met een paar creatieve vergelijkingen.

1. Het Probleem: De Traditionele Manier

Stel je voor dat je wilt weten welke honden (fagen) in een park (de natuur) leven.

• De oude methode: Je pakt één hondenkennel (één bacterie), loopt naar het park, en wacht tot er een hond langs komt die die specifieke hond wil bijten. Als er niets gebeurt, ga je naar een andere kennel. Je moet dit voor elke hondenras apart doen. Het is traag, je loopt veel rond, en je moet vaak zware tassen (centrifuges en filters) sjouwen om de modder uit het park te halen.

2. De Oplossing: HtPIP (Het Slimme Net)

De onderzoekers hebben een nieuw systeem bedacht, gebaseerd op een idee uit de landbouw (de iChip).

• Het concept: In plaats van één hondenkennel, heb je nu een groot raam met 96 kleine vakjes (een 96-wells plaat). In elk vakje zit een andere soort hond (een andere bacterie).
• Het raam: Dit raam is gemaakt van een heel fijn gaas (een filter van 0,2 micrometer). Dit gaas is zo fijn dat de honden (bacteriën) er niet doorheen kunnen, maar de kleine hondjes (fagen) wel.
• De actie: Je legt dit raam direct op de modderige grond van het park (een monster uit rioolwater of de grond).
• Het resultaat: De fagen in de modder zwemmen door het gaas naar binnen en vinden hun specifieke honden. Ze beginnen zich te vermenigvuldigen. Omdat je 96 verschillende honden tegelijkertijd in het raam hebt, kun je in één keer zoeken naar fagen voor 96 verschillende bacteriën.

De analogie: Het is alsof je een gigantisch, slim visnet uitrolt dat 96 verschillende soorten vis (bacteriën) tegelijkertijd vangt, terwijl het net zelf in de rivier ligt. Je hoeft niet meer handmatig modder te zeven; de natuur doet het werk voor je door het gaas.

3. Wat hebben ze ontdekt?

Met dit nieuwe "net" hebben de onderzoekers 12 nieuwe soorten fagen gevonden die ze nog nooit eerder hadden gezien.

• Verscheidenheid: Ze vonden fagen voor bacteriën die moeilijk te vinden waren, zoals bacteriën die in de grond leven (Rhodococcus) en zelfs een bacterie die normaal gesproken als "veilig" wordt beschouwd (Microbacterium).
• De RNA- verrassing: Het meest opwindende was dat ze een RNA-fage vonden. De meeste fagen die we kennen zijn van DNA (zoals onze eigen genen). Deze nieuwe fage, genaamd Later, is gemaakt van RNA en valt een bacterie aan die normaal gesproken niet door RNA-fagen wordt aangevallen. Het is alsof ze een nieuwe soort "alien" hebben gevonden in een heel ander deel van de stad.
• De lange staarten: Sommige van deze nieuwe fagen hebben staarten die zo lang zijn (400 nanometer), dat het lijkt alsof ze een ladder hebben om door de dikke muren van de bacteriën te klimmen.

4. Waarom is dit belangrijk?

• Snelheid: Het duurt veel minder tijd dan de oude methode. Geen zware machines meer nodig om modder te filteren.
• Diversiteit: Ze vonden veel meer nieuwe soorten dan met de oude methode. Het is alsof ze met een nieuw, beter visnet veel meer soorten vissen vingen dan met hun oude hengel.
• Toekomst: Dit helpt ons om medicijnen te maken tegen antibiotica-resistente bacteriën (fagentherapie) of om bacteriën te gebruiken voor het maken van schone energie en nieuwe materialen. We hebben nu een betere manier om de "politieagenten" te vinden die we nodig hebben.

Kortom:
De onderzoekers hebben een slimme, snelle en goedkope manier bedacht om de microscopische wereld te verkennen. In plaats van één voor één te zoeken, hebben ze een systeem gebouwd dat de natuur laat werken voor hen, waardoor ze een schat aan nieuwe virusjes hebben gevonden die eerder onzichtbaar waren. Het is een grote stap voorwaarts in het begrijpen van de microscopische wereld die ons omringt.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Bacteriofagen (fagen) zijn overal in de natuur aanwezig en hebben grote potentie voor biotechnologische toepassingen, zoals geneesmiddelen tegen antibiotica-resistente bacteriën, biocontrol en genlevering. Echter, er is een groot tekort aan geïsoleerde fagen voor de meeste bekende bacteriestammen. Traditionele methoden voor fage-isolatie zijn:

• Laag doorvoervermogen (low-throughput): Ze zijn gericht op één gastheer per experiment.
• Tijdsintensief en kostbaar: Ze vereisen meerdere handmatige stappen, zoals centrifugeren en filtreren van omgevingsmonsters (zoals bodem of afvalwater).
• Beperkte diversiteit: Ze missen vaak zeldzame fagen of fagen die specifieke, niet-model bacteriën infecteren.

Er is behoefte aan een methode die gelijktijdig fagen kan ontdekken voor meerdere bacteriestammen, de isolatietijd verkort en de diversiteit van de gevangen fagen vergroot.

Methodologie: Het HtPIP-platform

De auteurs hebben het High-Throughput Phage Isolation Platform (HtPIP) ontwikkeld, geïnspireerd door het iChip-systeem voor het kweken van onkweekbare bacteriën. Het platform maakt gebruik van commercieel beschikbare 0,2-micron filterplaten (MultiScreen-GV).

Het werkingsprincipe:

1. Opzet: Bacteriële gastheerculturen worden verdund in vloeibaar of semi-vast medium (agar) en in de bovenste compartimenten van de filterplaat geladen.
2. Incubatie: De plaat wordt op een omgevingsmonster (bijv. afvalwater of bodemslurrie) geplaatst. De semipermeabele membraan laat fagen en voedingsstoffen door, maar houdt de bacteriën in de plaat en de omgevingsmicrobiota in het monster gescheiden.
3. In situ verrijking: Fagen uit het omgevingsmonster kunnen door de membraan diffunderen, infectie veroorzaken in de bacteriën in de plaat, en zich vermenigvuldigen ("bloomen").
4. Verwerking: Na incubatie (68 uur bij 20°C) worden de inhoud van de putjes gefilterd (via centrifugatie in plaats van handmatige injectiespuitfiltratie) om bacteriën te verwijderen en de fagen te recupereren.

Optimalisatie:
De auteurs optimaliseerden de condities met modelorganismen (E. coli en Pseudomonas putida). Ze stelden vast dat:

• Een verzegelde plaat (om verdamping te voorkomen) essentieel is, vooral bij semi-vaste media.
• Een lage dichtheid van de gastheer bacteriën in semi-vaste media de opbrengst verhoogt.
• Centrifugatie-filtering even effectief is als handmatige filtratie, maar veel sneller is.

Belangrijkste Bijdragen

1. Schaalbaarheid: Het platform maakt het mogelijk om tot 96 verschillende bacteriestammen gelijktijdig te screenen tegen één omgevingsmonster.
2. Vereenvoudiging: Het elimineert de tijdrovende en risicovolle stappen van het centrifugeren en filtreren van het oorspronkelijke omgevingsmonster.
3. Diversiteit: Het is ontworpen om een bredere diversiteit aan fagen te vangen, inclusief die met lage abundantie, door het creëren van een dynamische in situ pool.
4. RNA-fagen: Het platform bleek succesvol in het isoleren van zowel DNA- als RNA-fagen.

Resultaten

De auteurs testten HtPIP met 11 verschillende bacteriestammen (waaronder E. coli, Pseudomonas, Rhodococcus, Variovorax, Bacillus, Burkholderia, Sphingopyxis en Microbacterium) tegen 9 verschillende omgevingsmonsters.

Isolatie en Taxonomie:

• 12 nieuwe fagen werden geïsoleerd voor 9 verschillende gastheergenera.
• 11 van de 12 fagen definiëren nieuwe fagesoorten; 9 daarvan definiëren nieuwe geslachten.
• Morfologie: Er werden diverse morfotypes gevonden, waaronder Siphoviridae, Myoviridae, Tectiviridae en Leviviricetes.
• Opmerkelijke vondsten:
  • Microbacterium phage Later: Dit is de eerste gekweekte RNA-fage (Leviviricetes) die een gastheer buiten de Proteobacteria infecteert (namelijk een Microbacterium stam, een Gram-positieve bacterie). Dit is een doorbraak, aangezien Leviviridae eerder alleen van Gram-negatieve gastheren bekend waren.
  • Rhodococcus-fagen: Vier nieuwe fagen met uitzonderlijk lange staarten (400-460 nm), wat mogelijk noodzakelijk is om de dikke celwand van Rhodococcus te doordringen.
  • Tectiviridae: Isolatie van een nieuwe Tectiviridae (Tolp) die Pseudomonas putida infecteert.

Vergelijking met Traditionele Methoden:
Via metagenomische analyse (metaviromes) van E. coli-enrichment culturen uit afvalwater werd een vergelijking gemaakt tussen HtPIP en traditionele methoden:

• HtPIP (zowel vloeibaar als semi-vast) leverde een hogere proportie van unieke ("outlier" en "singleton") virale contigs op vergeleken met traditionele methoden.
• Traditionele methoden vonden voornamelijk fagen die al bekend waren ("clustered"), terwijl HtPIP een uniekere set van nog onontdekte fagen blootlegde.

Betekenis en Conclusie

Het HtPIP-platform vertegenwoordigt een significante doorbraak in de fagediscovery:

• Efficiëntie: Het vermindert de tijd en complexiteit van fage-isolatie aanzienlijk, wat essentieel is voor het opbouwen van uitgebreide fagebibliotheken.
• Toegang tot "donkere materie": Het platform maakt het mogelijk om fagen te vinden voor niet-model bacteriën en voor bacteriën waarvoor nog geen fagen bekend zijn, wat cruciaal is voor toepassingen in de synthetische biologie en de bestrijding van antibiotica-resistentie.
• Nieuwe inzichten: De ontdekking van een RNA-fage die Gram-positieve bacteriën infecteert, daagt bestaande kennis over de gastheerbereik van Leviviridae uit en opent nieuwe vragen over infectiemechanismen.
• Toekomstperspectief: Het platform is compatibel met geautomatiseerde laboratoriumsystemen en kan worden aangepast voor tijdreeksstudies in veranderende omgevingen, waardoor het een krachtig hulpmiddel wordt voor de toekomstige fagebiotechnologie.