Open Blink: Low-cost TIRF microscopy for super-resolutionimaging via μManager

Dit artikel introduceert Open Blink, een kosteneffectief en open-source TIRF-microscoop op basis van μManager die toegankelijke, hoogwaardige super-resolutiebeeldvorming mogelijk maakt voor biologisch onderzoek.

De kern

Open Blink: De goedkope, open-source super-microscoop voor iedereen

Stel je voor dat je een heel klein dier wilt bekijken, zoals een virus of een eiwit in een cel. Normaal gesproken heb je daar een microscoop voor nodig die zo groot is als een auto en zo duur als een luxe villa. Deze dure apparaten kunnen dingen zien die kleiner zijn dan een haar, maar voor de meeste onderzoekers zijn ze onbetaalbaar en te ingewikkeld om zelf te bouwen.

De auteurs van dit artikel hebben een oplossing bedacht: Open Blink. Het is een microscoop die je zelf kunt bouwen, die veel goedkoper is, en die toch net zo goed werkt als die dure modellen.

Hier is hoe het werkt, vertaald in alledaagse taal:

1. De "Lichtmixer" (De Laser)

Om zulke kleine dingen te zien, heb je heel fel licht nodig. In dure microscopen zijn de lasers vaak gigantisch duur.

• De analogie: Stel je voor dat je een orkest nodig hebt. In dure microscopen huur je één beroemd, duur orkest (een enkele, krachtige laser). Bij Open Blink hebben ze een slimme truc bedacht: ze nemen vier goedkopere, maar krachtige "solisten" (diode-lasers) en mixen hun geluiden (licht) samen tot één perfect orkest.
• Het resultaat: Ze hebben een "lichtmixer" gebouwd die vier verschillende kleuren licht samenvoegt. Door deze lasers te laten trillen (met een kleine motor, net als een telefoon die trilt), wordt het licht over het hele beeld gelijkmatig verdeeld. Het is alsof je een spetterende regenboog hebt die overal even fel schijnt, zonder donkere vlekken. Dit kost een fractie van de prijs van de dure alternatieven.

2. De "Grote Lente" (Het Microscooplichaam)

Een microscoop moet heel stabiel zijn, want als hij een beetje beweegt, wordt het beeld wazig.

• De analogie: Ze hebben een bestaand, open-source frame (een soort "lego-blokken" voor microscopen) aangepast. Ze hebben het frame iets smaller gemaakt, net als het inkrimpen van een broek, zodat ze een kortere lens konden gebruiken.
• Het voordeel: Door deze slimme aanpassing kunnen ze nu een heel groot stukje van de cel zien tegelijk (een groot "veld van zicht"). Het is alsof je van een verrekijker met een klein kijkvenstertje overstapt op een panoramisch raam. Je ziet meer cellen in één keer, zonder dat de kwaliteit van het beeld verslechtert.

3. De "Onzichtbare Hand" (Focus-lock)

Bij het maken van super-scherpe foto's moet je duizenden foto's maken. Dat duurt lang. Als de microscoop ook maar een heel klein beetje zakt of stijgt (door temperatuur of trillingen), wordt je hele foto wazig.

• De analogie: Stel je voor dat je een foto maakt van een dansende ballerina, maar je camera beweegt mee. Je krijgt een wazige foto. Open Blink heeft een "onzichtbare hand" die de camera altijd op de juiste hoogte houdt.
• Hoe het werkt: Ze gebruiken een onzichtbaar infrarood laserstraaltje (zoals een laseraanwijzer voor katten, maar dan voor de microscoop) dat op het glas van de cel schijnt. Een sensor kijkt of dit lichtje verschuift. Als de microscoop een beetje zakt, stuurt de computer direct een signaal om de tafel weer omhoog te duwen. Het is alsof je een zelfregulerende cruisecontrol hebt voor je microscoop, zodat hij urenlang perfect scherp blijft staan.

4. De "Besturingssoftware" (µManager)

Vaak moet je als wetenschapper zelf programmeren om een zelfgebouwde microscoop te laten werken. Dat is als een auto bouwen en dan zelf ook de motor en het stuur moeten programmeren.

• De oplossing: Open Blink werkt met µManager. Dit is een gratis, open-source softwareprogramma dat al door duizenden onderzoekers wordt gebruikt. Het is als een universele afstandsbediening die al voor je werk heeft gedaan. Je hoeft geen code te schrijven; je klikt gewoon op knoppen om de lasers aan te zetten of de camera te starten.

Waarom is dit belangrijk?

Voorheen was "super-resolutie microscopie" (het zien van dingen op nanometer-schaal) alleen weggelegd voor rijke universiteiten met speciale laboratoria.

• De kosten: Een commercieel systeem kost vaak meer dan €280.000. Open Blink kost ongeveer €70.000. Dat is alsof je in plaats van een dure sportwagen een zeer snelle, betrouwbare elektrische auto koopt die je zelf kunt onderhouden.
• De impact: Omdat het ontwerp openbaar is (iedereen mag de blauwdrukken zien en kopiëren), kunnen laboratoria over de hele wereld deze microscopen bouwen. Dit betekent dat meer onderzoekers, ook in kleinere universiteiten of in ontwikkelingslanden, toegang krijgen tot de allerbeste technologie om ziektes te bestuderen en nieuwe medicijnen te vinden.

Kortom: Open Blink is de "IKEA" van de super-microscopen: goedkoop, zelf te bouwen, gebruiksvriendelijk, maar met een kwaliteit die net zo goed is als de dure merken. Het maakt wetenschap democratischer en toegankelijker voor iedereen.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Super-resolutie localisatiemicroscopie (SMLM) is een cruciale techniek voor nanoschaal biologisch onderzoek vanwege zijn hoge ruimtelijke resolutie en compatibiliteit met wide-field microscopie. Hoewel er open-source alternatieven bestaan, zijn deze vaak beperkt door:

1. Hoge kosten en complexiteit: Commerciële systemen zijn zeer duur en technisch complex.
2. Beperkte toegankelijkheid: Implementatie vereist vaak expertkennis in optica, elektronica en besturingssystemen.
3. Gebrek aan integratie: Bestaande open-source projecten missen vaak volledig geïntegreerde besturingssoftware of bieden onvoldoende laservermogen en gezichtsveld (FOV).
4. Technische uitdagingen: Het behalen van homogene verlichting over een groot veld, nanometrische axiale stabiliteit en precieze multi-kanaals detectie is technisch veeleisend en vaak beperkt tot high-end apparatuur.

Methodologie: Open Blink

De auteurs introduceren Open Blink, een compacte, open-source TIRF-microscoop (Total Internal Reflection Fluorescence) die is ontworpen voor kwantitatieve multi-kleur super-resolutie imaging. Het systeem is gebouwd met voornamelijk kant-en-klare componenten en is volledig geïntegreerd in de open-source software µManager.

De belangrijkste technische componenten en aanpassingen zijn:

• Lage-kosten, hoogvermogen lasercombinator:

  • In plaats van dure single-mode lasers, worden semi-turnkey diodelasers gebruikt (405 nm, 488 nm, twee x 638 nm en een DPSS 561 nm).
  • Twee 638 nm lasers worden gecombineerd via een polariserende beam splitter om het vermogen te verdubbelen.
  • Het gecombineerde licht wordt via een multimode optische vezel (MMF) met een vierkante kern (70x70 µm) geleid.
  • Homogeniteit: Om de onhomogene "speckle"-patronen van de MMF te elimineren, wordt de vezel geschud door een vibratiemotor (VM). Dit zorgt voor een homogene verlichting over het hele beeldveld.
  • Een speciaal ontworpen controller (op basis van micro-controllers) regelt de laserintensiteit en de vibratiesnelheid via µManager-plugins.

• Microscooplichaam en Optica:

  • Gebaseerd op het open-source frame miCube, maar aangepast met een bredere optische pad (verkleining van de breedte naar 80 mm) om een kortere focussende lens (150 mm) te kunnen plaatsen.
  • Dit ontwerp maakt het mogelijk om een groot gezichtsveld (FOV) te bereiken (tot 257 x 257 µm²) terwijl de TIRF-condities behouden blijven.
  • Er is een schakelmechanisme ingebouwd om tussen een groot FOV (voor hoge doorvoer) en een klein FOV met hoge intensiteit (voor dSTORM) te wisselen door een telescoop-configuratie van lenzen toe te voegen of te verwijderen.
  • Detectie gebeurt via een dual-channel opstelling (gesplitst bij 595 nm) op een sCMOS-camera, met een vergroting van 59,9x.

• Actieve Focus-lock (fgFocus):

  • Om drift tijdens lange opnames te voorkomen, is een focus-lock module ontwikkeld genaamd fgFocus (gebaseerd op pgFocus/qgFocus).
  • Een infraroodstraal (830 nm) wordt via een dichroïde spiegel in het TIRF-pad gekoppeld. De reflectie wordt gedetecteerd door een lineaire sensor.
  • Een PID-regelaar (Proportional-Integral-Derivative) corrigeert de Z-posities van het monsterstadium in real-time.
  • De module is volledig geïntegreerd in µManager met een GUI voor kalibratie en lock-functies.

• Software-integratie:

  • Alle hardware wordt aangestuurd via µManager.
  • Aangepaste plugins (geschreven in C++/Python voor pycroManager) zorgen voor de communicatie met de micro-controllers (Raspberry Pi Pico en XIAO SAMD21).
  • Belangrijk: Metadata (zoals laservermogen, stage-posities en blootstellingstijd) wordt automatisch bij elke afbeelding geregistreerd, wat reproduceerbaarheid garandeert.

Belangrijkste Resultaten

1. Locatieprecisie en Homogeniteit:
   • Het systeem bereikt een locatieprecisie van < 10 nm in dSTORM (8,21 nm gemeten).
   • De homogene verlichting zorgt voor consistente resolutie over het hele beeldveld, wat werd aangetoond via DNA-PAINT imaging op vijf verschillende regio's.
2. Stabiliteit:
   • De fgFocus-module reduceert axiale drift aanzienlijk. Gedurende 250 minuten was de drift zonder lock 94,2 nm, terwijl deze met de lock gemiddeld -1,58 nm (± 2,00 nm SD) bedroeg.
3. Verschillende Imaging-modi:
   • dSTORM: Succesvol uitgevoerd met Alexa Fluor 647 op hoge intensiteit (1,2 kW/cm²).
   • DNA-PAINT: Getoond met Cy3B-imagers onder TIRF-condities, met een precisie van 13,0 nm.
   • SOFI (Super-resolution Optical Fluctuation Imaging): Tweede-orde SOFI reconstructie van microtubuli met hoge doorvoer (4x4 tiles samengesteld tot 0,23 x 0,23 mm).
4. Kosten:
   • De totale kosten van het systeem bedragen ongeveer 70.000 Euro, wat aanzienlijk lager is dan commerciële systemen (ongeveer een kwart van de prijs). De lasercombinator alleen kost minder dan 20.000 Euro.

Significantie en Impact

Open Blink overbrugt de kloof tussen state-of-the-art super-resolutie prestaties en brede toegankelijkheid voor onderzoekers.

• Toegankelijkheid: Het systeem maakt geavanceerde SMLM-technieken (dSTORM, DNA-PAINT, SOFI) beschikbaar voor laboratoria met beperkte budgetten, zonder in te leveren op optische kwaliteit.
• Gebruiksgemak: Door volledige integratie in µManager en het gebruik van semi-turnkey componenten, wordt de drempel voor implementatie, gebruik en onderhoud verlaagd. Er is minder expertise in elektronica en programmering vereist.
• Reproduceerbaarheid: De nadruk op metadata-registratie en open-source beschikbaarheid (CAD-bestanden, PCB-ontwerpen, firmware en plugins zijn beschikbaar via GitHub en 4TU.ResearchData) bevordert reproduceerbaar onderzoek.
• Scalabiliteit: Het modulaire ontwerp stelt onderzoekers in staat om het systeem aan te passen aan specifieke behoeften (bijv. live-cell imaging met omgevingscontrole) en kan dienen als platform voor geautomatiseerde "smart microscopy".

Kortom, Open Blink demonstreert dat hoogwaardige, kwantitatieve single-molecule super-resolutie microscopie niet langer het exclusieve domein is van dure commerciële platformen, maar haalbaar is voor de bredere wetenschappelijke gemeenschap.