An apical junction protein antagonizes mechanosensitive calcium signaling to establish stochastic choices of olfactory neuron subtypes

Deze studie toont aan dat het apicale junction-proteïne AJM-1 in *Caenorhabditis elegans* de stochastische lateraliteit van olfactorische neuronen reguleert door de expressie van SLO-1 te bevorderen en mechanosensitieve calciumsignalering te antagoniseren, waardoor de differentiatie naar het AWCON-subtype wordt gestimuleerd.

De kern

Titel: Hoe een 'Kleefband' in de hersenen bepaalt of je links of rechts bent

Stel je voor dat je hersenen een enorme bouwplaats zijn. Tijdens de ontwikkeling moeten cellen beslissen: "Word ik de linkse versie van deze cel of de rechtse versie?" In de mens gebeurt dit vaak op een complexe manier, maar in de kleine rondworm C. elegans (een wormpje dat we veel gebruiken in onderzoek) is dit proces heel mooi te zien bij twee neuscellen (AWC-cellen).

Normaal gesproken maakt de worm een perfecte balans: één linkse cel en één rechtse cel. Ze zijn bijna identiek, maar ze kiezen willekeurig (stochastisch) welke kant ze opgaan. De ene wordt de "butanone-detecteur" (AWCON) en de andere de "pentanedione-detecteur" (AWCOFF).

Deze studie, uitgevoerd door Rui Xiong en collega's, heeft ontdekt dat mechanische kracht (een fysieke trekkracht) en een eiwit dat we AJM-1 noemen, de sleutel zijn tot deze keuze.

Hier is de uitleg in simpele taal, met een paar creatieve vergelijkingen:

1. De Bouwplaats en de Trekkracht

Tijdens de ontwikkeling van de worm, bewegen de cellen en hun "tentakels" (dendrieten) naar hun eindbestemming. Stel je voor dat de cellen als een touw zijn dat aan de muur vastzit, maar de cel zelf beweegt weg. Hierdoor ontstaat er trekkracht (mechanische spanning) op de plekken waar de cellen aan elkaar vastzitten.

Deze plekken waar cellen aan elkaar plakken, worden tight junctions genoemd. Het zijn als het ware de "klevende banden" of de "naadjes" tussen de cellen.

2. AJM-1: De Wacht die de Spanning Regelt

Het eiwit AJM-1 zit precies op die klevende banden. De onderzoekers ontdekten dat AJM-1 niet alleen een lijm is, maar een regelaar.

• Het probleem: Als AJM-1 kapot gaat (zoals in de wormen met de mutatie vy11), dan wordt de trekkracht te sterk of wordt hij verkeerd gevoeld.
• Het gevolg: De cellen denken dat ze in een andere situatie zitten. In plaats van dat er één linkse en één rechtse cel ontstaat, worden beide cellen de "rechter" variant (AWCOFF). De worm verliest zijn neus voor butanone en kan die geur niet meer ruiken.

3. De Strijd tussen twee Krachten: De Rem en het Gaspedaal

De studie beschrijft een gevecht tussen twee systemen in de cel:

• Het Gaspedaal (Calcium & DEL-1): Er is een kanaal genaamd DEL-1 dat reageert op mechanische kracht (zoals een sensor die voelt dat er getrokken wordt). Als dit kanaal wordt geactiveerd, opent het een "gaspedaal" voor calcium. Dit calcium-signaal zorgt ervoor dat de cel de AWCOFF-identiteit kiest (de standaardstandaard).
• De Rem (SLO-1): Gelukkig heeft de cel ook een rem, genaamd SLO-1. Deze rem houdt het calcium-signaal tegen. Als de rem werkt, kan de cel de AWCON-identiteit kiezen (de speciale, geïnduceerde stand).

De rol van AJM-1:
AJM-1 werkt als een slimme bestuurder. Hij doet twee dingen:

1. Hij zorgt dat de rem (SLO-1) sterk genoeg is.
2. Hij blokkeert het gaspedaal (DEL-1). Hij doet dit waarschijnlijk door de mechanische spanning op de "klevende banden" te regelen. Als AJM-1 goed werkt, voelt de cel minder trekkracht, gaat het gaspedaal niet open, en kan de rem werken. De cel kiest dan voor de AWCON-variant.

4. Het Verassende Detail: Het werkt ook van buitenaf!

Het meest interessante is dat AJM-1 niet alleen in de zenuwcel zelf werkt, maar ook in de omringende cellen (zoals de "glia" en de huidcellen/hypodermis).

• Vergelijking: Stel je de zenuwcel voor als een auto. AJM-1 is niet alleen de bestuurder in de auto, maar ook de wegwerknemer en de weg zelf. Als de weg (de glia/huid) niet goed is opgebouwd, kan de bestuurder (de zenuwcel) zijn keuze niet maken, zelfs als de bestuurder zelf gezond is.
• De onderzoekers bewezen dit door AJM-1 alleen in de glia-cellen te herstellen. Dat was genoeg om de zenuwcellen weer normaal te laten kiezen!

Samenvatting in één zin

Deze studie laat zien dat fysieke trekkracht op de "klevende banden" tussen cellen, geregeld door het eiwit AJM-1, bepaalt of een hersencel links of rechts wordt, door een chemisch gevecht tussen een rem en een gaspedaal te sturen.

Waarom is dit belangrijk?
Het laat zien dat onze hersenen niet alleen worden gebouwd door chemische signalen, maar ook door fysieke kracht. Net zoals een brug moet kunnen buigen zonder te breken, moeten onze hersencellen de mechanische spanning voelen om te beslissen wie ze worden. Dit is een nieuw stukje in de puzzel van hoe ons lichaam links-rechts asymmetrie ontwikkelt.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Mechanische krachten spelen een bekende rol in de ontwikkeling van het brein en de linker-rechter-asymmetrie van het lichaam. Echter, de specifieke rol van mechanische signalering bij de lateralisatie van het brein (de asymmetrische differentiatie van neuronen) blijft onduidelijk.
In de nematode Caenorhabditis elegans differentieert het paar linker- en rechter AWC-olfactorische neuronen op een stochastische manier in twee subtypen: het geïnduceerde AWCON-type en het standaard AWCOFF-type. Hoewel bekend is dat calciumsignaleringspaden en gap junctions hierbij betrokken zijn, is het mechanisme dat deze stochastische keuze reguleert, en de mogelijke invloed van mechanische spanning op deze keuze, niet volledig opgelost.

Methodologie

De auteurs gebruikten een combinatie van genetische, moleculaire en beeldvormingstechnieken in C. elegans:

1. Genetische screens: Een onbevooroordeelde forward genetic screen werd uitgevoerd om mutanten te vinden die het fenotype van slo-1(gf) (dat leidt tot twee AWCON-neuronen, 2AWCON) onderdrukten. Dit resulteerde in de identificatie van de vy11-mutant.
2. Genetische analyse:
   • RNAi: Om de specifieke isoformen van het gen ajm-1 te testen die verantwoordelijk zijn voor het fenotype.
   • Rescue-experimenten: Expressie van ajm-1 onder verschillende weefselspecifieke promotoren (neuronaal, gliaal, hypodermisch) in mutanten om cel-autonome versus niet-cel-autonome functies te onderscheiden.
   • Mosaic analyse: Gebruik van onstabiele extrachromosomale arrays en reporters om te bepalen in welke celstamlijnen ajm-1 nodig is voor herstel van het fenotype.
   • Genetische interacties: Dubbelmutantanalyses met genen zoals del-1, unc-2, egl-19 en slo-1 om de signaalweg te ontrafelen.
3. Genome Editing (CRISPR/Cas9):
   • Generatie van knock-in stammen met fluorescente tags (mNeonGreen, TagRFP-T, GFP11) en degradatiedomains (ZF1) om endogene eiwitten te visualiseren en te degraderen op specifieke tijdstippen en in specifieke weefsels.
   • Gebruik van het ZF1/ZIF-1 systeem en GFP-nanobody/ZIF-1 systeem voor tijds- en weefselspecifieke degradatie van eiwitten (AJM-1, SLO-1, DEL-1, DLG-1, LET-413).
4. Microscopie en beeldvorming:
   • Immunofluorescentie en split-GFP-technieken om de subcellulaire lokalisatie van AJM-1 te visualiseren in tight junctions tussen neuronen, glia en hypodermis.
   • Chemotaxis-assays om de functionele uitkomst van de neuronale differentiatie te testen (reageren op butanon vs. 2,3-pentanedion).

Belangrijkste Bijdragen en Resultaten

1. Identificatie van AJM-1 als regulator van AWC-asymmetrie:
De studie identificeerde AJM-1 (apical junction molecule 1) als een cruciale regulator. De vy11-mutant (een missense-mutatie die leidt tot een verlaagde expressie van AJM-1) veroorzaakt een fenotype waarbij beide AWC-neuronen het AWCOFF-type worden (2AWCOFF), wat aangeeft dat AJM-1 nodig is voor de vorming van het AWCON-type.

2. Rol van niet-cel-autonome signalering:
AJM-1 is niet alleen nodig in de neuronen zelf, maar heeft een niet-cel-autonome functie in niet-neuronale cellen.

• Expressie van ajm-1 in glia (sheath en socket glia) en hypodermis (epidermis) is voldoende en noodzakelijk om het AWCON-fenotype te herstellen.
• Expressie alleen in neuronen is niet voldoende.
• De belangrijkste isoformen voor dit proces zijn ajm-1b en ajm-1c, die specifiek tot expressie komen in glia en hypodermis.

3. Tijdsafhankelijkheid:
AJM-1 is specifiek vereist tijdens de embryogenese (tussen 2 en 8 uur na eileg, overeenkomend met de gastrulatie tot het 3-voudige stadium), wat samenvalt met de periode van retrograde extensie van neurale en gliale processen. Het is niet nodig voor het behoud van de asymmetrie in latere stadia.

4. Mechanisme: Antagonisme van mechanosensitieve calciumsignalerings:
De auteurs stellen een model voor waarin AJM-1 de AWCON-identiteit bevordert door twee mechanismen:

• Promotie van SLO-1: AJM-1 is nodig voor de expressie van SLO-1 (een BK-kaliumkanaal) in de AWC-neuronen. SLO-1 remt calciumsignaleringspaden die nodig zijn voor AWCOFF.
• Remming van mechanosensitieve kanalen: AJM-1 antagoniseert de activiteit van DEL-1, een mechanosensitief DEG/ENaC-kanaal.
  • In de AWCOFF-neuronen activeert DEL-1 voltage-geactiveerde calciumkanalen (UNC-2 en EGL-19), wat leidt tot een calciuminstroom, activatie van een kinase-cascade (UNC-43/TIR-1/NSY-1) en tot expressie van AWCOFF-markers.
  • AJM-1 remt dit pad waarschijnlijk door de mechanische spanning op de tight junctions te moduleren, waardoor DEL-1 minder actief is. Dit verlaagt de calciuminstroom, waardoor SLO-1 kan werken en de neuron AWCON wordt.

5. Rol van andere junctionele eiwitten:
De eiwitten DLG-1 en LET-413 (homologen van Discs large en Scribble), die essentieel zijn voor de lokale integratie van AJM-1, spelen ook een rol in de AWC-asymmetrie wanneer ze in glia/hypodermis worden gereduceerd, wat de afhankelijkheid van de apicale junction-complex bevestigt.

Significantie

• Nieuw inzicht in mechanotransductie: Dit is de eerste studie die aantoont dat apicale junction-eiwitten een niet-cel-autonome rol spelen bij het reguleren van stochastische celkeuzes in het zenuwstelsel via mechanische signalering.
• Link tussen mechanica en hersenlateralisatie: De studie biedt een mechanistisch model voor hoe mechanische krachten (gegenereerd door de migratie van neuronen en glia tijdens de retrograde extensie) via AJM-1 en DEL-1 worden omgezet in biochemische signalen (calcium) die de linker-rechter asymmetrie van neuronen bepalen.
• Model voor stochastische differentiatie: Het onthult een elegant mechanisme waarbij een evenwicht tussen mechanosensitieve calciumkanalen (DEL-1/UNC-2/EGL-19) en kaliumkanalen (SLO-1), gemedieerd door junctionele eiwitten (AJM-1), de stochastische keuze tussen twee neuronale subtypen bepaalt.
• Breedere implicaties: De bevindingen suggereren dat mechanische spanning op cellulaire junctions een fundamenteel signaal kan zijn voor de ontwikkeling van het zenuwstelsel, wat relevant is voor het begrijpen van neuro-ontwikkelingsstoornissen en brein lateraliteit bij hogere organismen.

Samenvattend toont dit werk aan dat de apicale junction-molecule AJM-1 fungeert als een mechanische sensor of modulator in glia en hypodermis die calciumsignaleringspaden in neuronen remt, waardoor de stochastische keuze voor het AWCON-neuronstype wordt bevorderd.