Loss of Mycobacterium marinum ESX-1 genes increase transcription of ESX-6 genes

Dit onderzoek toont aan dat het verlies van ESX-1-genen in de *Mycobacterium marinum*-stam 1218S leidt tot verhoogde transcriptie van ESX-6- en LOS-genen, wat samenhangt met de vorming van gladde koloniën en biofilms.

De kern

Deel 1: De Twee Broers en hun Geheime Wapenarsenal

Stel je twee broers voor die in een vijver wonen: 1218R (de 'Ruwe') en 1218S (de 'Zachte'). Ze zijn familie van de bacterie Mycobacterium marinum, die visjes ziek kan maken.

• 1218R is de agressieve broer. Hij heeft een ruwe, stekelige huid en is een dodelijke vijand voor vissen.
• 1218S is de vredelievende broer. Hij heeft een gladde, zachte huid en is veel minder gevaarlijk.

Waarom is de ene zo slecht en de andere zo zacht? De wetenschappers hebben ontdekt dat het te maken heeft met een soort geheime wapenarsenaal in hun cellen, genaamd het ESX-1-systeem. Dit systeem is als een raketlanceringssysteem dat virulente (ziekteverwekkende) stoffen deeltjes deelt.

Het Grote Verlies:
De 'Zachte' broer (1218S) heeft een groot deel van dit raketlanceringssysteem kwijtgeraakt. Het is alsof hij zijn raketten en brandstof heeft verloren. Hierdoor kan hij niet meer zo goed aanvallen.

Het Slimme Compensatieplan:
Maar hier wordt het interessant. De bacterie heeft een back-up systeem (genaamd ESX-6).

• Bij de 'Ruwe' broer is dit back-up systeem bijna inactief; hij vertrouwt op zijn hoofdwapen (ESX-1).
• Bij de 'Zachte' broer is er iets raars gebeurd: omdat hij zijn hoofdwapen (ESX-1) kwijt is, schakelt zijn hersenpan over. Hij begint het back-up systeem (ESX-6) extreem hard te laten werken. Het is alsof hij, omdat hij zijn geweer kwijt is, zijn pistool met twee handen vasthoudt en er een machinepistool van maakt. Hij probeert het verlies van zijn grote wapen te compenseren door het kleine wapen te overdrijven.

De Gladde Huid (De 'Smooth' Factor)
Naast hun wapens hebben ze ook een huid.

• De 'Ruwe' broer heeft een ruwe huid (zoals schuurpapier).
• De 'Zachte' broer heeft een gladde, slijmerige huid (zoals een zeepbel).

De wetenschappers dachten eerst dat de 'Zachte' broer andere genen had voor die gladde huid. Maar nee, de blauwdrukken (het DNA) voor de huid waren precies hetzelfde!
Het geheim zit in hoe hard die blauwdrukken worden gelezen.
In de 'Zachte' broer wordt het recept voor de gladde huid (de LOS-genen) veel harder afgeschreven, vooral als de bacterie 'oud' wordt (in de rustfase). Dit zorgt voor die gladde, slijmerige laag.

De Regisseur (Ms1 RNA)
Wie geeft het bevel om harder te werken? De onderzoekers vonden een kleine 'regisseur' genaamd Ms1 RNA.

• Deze regisseur wordt actiever als de bacterie ouder wordt.
• De 'Zachte' broer heeft meer van deze regisseur dan de 'Ruwe' broer.
• De regisseur zegt tegen de fabriek: "Maak meer van die gladde huidstoffen!" en "Gebruik het back-up wapen harder!"

Biofilms: De Bacteriële Stad
Bacteriën bouwen vaak steden, genaamd biofilms.

• De 'Ruwe' broer bouwt een sterke, onneembare stad.
• De 'Zachte' broer bouwt een zwakke stad.
  De onderzoekers dachten: "Misschien komt dat door de ontbrekende wapens?" Ze probeerden de ontbrekende wapens van de 'Ruwe' broer in de 'Zachte' broer te steken. Maar nee! De 'Zachte' broer bouwde nog steeds geen sterke stad. Dit betekent dat het verschil in hun 'steden' niet alleen door de wapens komt, maar door een complexere oorzaak die we nog niet helemaal begrijpen.

Samenvatting in één zin:
De 'Zachte' bacterie is minder gevaarlijk omdat hij zijn grote wapen kwijt is, maar hij probeert dit te compenseren door zijn back-up wapen en zijn gladde huid extreem hard te activeren, gestuurd door een interne regisseur die harder werkt dan bij zijn 'Ruwe' broer.

Dit onderzoek helpt ons te begrijpen hoe bacteriën zich aanpassen en waarom sommige meer gevaarlijk zijn dan anderen, wat belangrijk is voor het vinden van nieuwe manieren om ziektes te bestrijden.

Technische samenvatting

Titel: Verlies van Mycobacterium marinum ESX-1-genen leidt tot verhoogde transcriptie van ESX-6-genen

Probleemstelling
Mycobacterium marinum (Mmar) vormt zowel ruwe (R) als gladde (S) kolonievormen, waarbij de ruwe variant (1218R) virulenter is dan de gladde variant (1218S). De gladde variant 1218S is geïsoleerd uit 1218R en vertoont een verminderde virulentie. Eerdere studies toonden aan dat 1218S een gedeeltelijke deletie heeft in het ESX-1 secretiesysteem, een cruciaal virulentiefactor-systeem in mycobacteriën. In Mmar is het ESX-1 gebied deels gedupliceerd, wat resulteert in het ESX-6 systeem. De precieze genomische verschillen tussen de volledige genoomsequenties van 1218R en 1218S, en hoe het verlies van ESX-1-genen de transcriptie van ESX-6, virulentiegene en lipooligosaccharide (LOS)-gerelateerde genen beïnvloedt, waren nog niet volledig in kaart gebracht. Daarnaast is de relatie tussen deze genetische veranderingen, kolonievorming (glad vs. ruw) en biofilmvorming onduidelijk.

Methodologie
De auteurs hebben een uitgebreide multi-omics benadering toegepast:

1. Genoomsequencing en -annotatie: Er is een compleet genoom van de 1218S-stam gegenereerd met behulp van PacBio-technologie (single scaffold), wat een verbetering was ten opzichte van eerdere draft-genomen. Dit werd vergeleken met de volledige genomen van 1218R en drie andere Mmar-stammen (CCUG 20998, ATCC 927T en M-stam).
2. Comparatieve Genomica: Er werd gebruikgemaakt van tools zoals RAST, VFanalyzer (VFDB database) en PanOCT om coderende sequenties (CDS), virulentiefactoren, ESX-genen en LOS-genen te identificeren en te vergelijken.
3. RNA-Seq Transcriptie-analyse: Totaal RNA werd geïsoleerd uit exponentieel groeiende en stationaire cellen van vier Mmar-stammen. RNA-Seq data werden gemapt op de respectievelijke genomen om transcriptieniveaus te kwantificeren (TPM-waarden), met een focus op ESX-systemen (ESX-1 t/m -6), virulentiegene (zoals espACD), regulatoren (WhiB6, EspR, PhoPR) en LOS-genen.
4. Functionele Validatie:
   • Overexpressie: Het Ms1 RNA (een niet-coderend RNA) werd geïnduceerd in de CCUG-stam om het effect op LOS- en ESX-genexpressie te testen.
   • Biofilm-assays: De biofilmvorming van 1218R en 1218S werd vergeleken, inclusief experimenten waarbij de ontbrekende ESX-1-genen (espF_2, espG1_2, espH) in 1218S werden teruggebracht via een plasmide.

Belangrijkste Bijdragen

• Volledig Genoom van 1218S: Het eerste complete genoom van de gladde 1218S-stam, wat bevestigde dat de eerdere "deleties" in het draft-genoom deels het gevolg waren van assemblageproblemen, maar dat er wel degelijk significante deleties en truncaties zijn.
• Regulatie van ESX-6: Het aantonen dat het verlies van ESX-1-genen in 1218S leidt tot een compensatoire verhoging van de transcriptie van ESX-6-genen.
• Rol van Ms1 RNA en RNase J: Het identificeren van Ms1 RNA en een mutatie in het rnaseJ-gen als mogelijke factoren die de transcriptiestabiliteit en expressie van LOS-genen beïnvloeden.
• Mechanisme van Kolonievorming: Het inzicht dat het fenotype (glad vs. ruw) niet alleen door genetische deleties wordt bepaald, maar ook door veranderingen in transcriptieniveaus en post-transcriptionele regulatie.

Resultaten

1. Genomische Verschillen:

   • Het genoom van 1218S is ongeveer 56 kb kleiner dan dat van 1218R.
   • In 1218S ontbreken meerdere ESX-1-genen (espF_2, espG1_2, espH, eccA1_3, eccB1_5, eccCa1_4, eccCb1, PE35, PPE68). De genen espF_2 en esxB_3 zijn echter niet volledig verdwenen maar getruncateerd door een deletie die leidt tot een frameshift.
   • Het gen lsr2 (een regulator van LOS-genen) is gedupliceerd in 1218S.
   • Er is een deletie in het midden van het rnaseJ-gen in 1218S, wat mogelijk de RNA-stabiliteit beïnvloedt.

2. Transcriptie van ESX-systemen:

   • In 1218R zijn ESX-1-transcripten hoog en ESX-6-transcripten laag.
   • In 1218S is dit patroon omgekeerd: ESX-1-transcripten (voor de resterende genen) zijn lager, maar ESX-6-transcripten zijn significant verhoogd, ongeacht de groeifase. Dit suggereert een compensatiemechanisme.
   • De transcriptie van espACD en regulatoren (whiB6, espM) is lager in 1218S dan in 1218R.

3. LOS-genen en Kolonievorming:

   • Hoewel de LOS-gensequenties en syntaxis identiek zijn tussen 1218R en 1218S, zijn de transcriptieniveaus van veel LOS-genen in stationaire 1218S-cellen hoger dan in 1218R.
   • Overexpressie van Ms1 RNA in de CCUG-stam leidde tot een toename van LOS-gen-transcripten (bijv. pimF, papA1_2), wat suggereert dat Ms1 RNA de expressie van LOS-genen positief reguleert.
   • De hogere transcriptie van LOS-genen in 1218S (in stationaire fase) correleert met het gladde koloniefenotype, ondanks de aanwezigheid van het repressor-gen lsr2 (dat hier gedupliceerd is).

4. Biofilm en Virulentie:

   • 1218R vormt een robuustere biofilm dan 1218S.
   • Het terugbrengen van de ontbrekende ESX-1-genen (espF_2, espG1_2, espH) in 1218S via een plasmide compenseerde het biofilm-tekort niet. Dit suggereert dat het verschil in biofilmvorming niet alleen door deze specifieke genen wordt bepaald, maar waarschijnlijk door een complexere interactie met het ESX-1 secretiesysteem als geheel.

Significantie
De studie biedt een diepgaand inzicht in de evolutionaire aanpassing van M. marinum en de plasticiteit van virulentiefactoren. De belangrijkste bevindingen zijn:

• Compensatoire Regulatie: Mycobacteriën kunnen het verlies van het primaire virulentiesysteem (ESX-1) compenseren door de expressie van het gedupliceerde systeem (ESX-6) te verhogen.
• Post-transcriptionele Regulatie: Het fenotype (glad vs. ruw) wordt niet alleen bepaald door de aanwezigheid van genen, maar sterk beïnvloed door transcriptiestabiliteit en regulatie door niet-coderend RNA (Ms1 RNA) en ribonucleasen (RNase J).
• Klinische Implicatie: Het begrijpen van hoe ESX-systemen en LOS-synthese de virulentie en biofilmvorming beïnvloeden, is cruciaal voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën tegen mycobacteriële infecties, aangezien biofilms vaak resistentie tegen antibiotica confereren.

De resultaten benadrukken dat de overgang van een virulente, ruwe stam naar een minder virulente, gladde stam een complex proces is dat genomische deleties, gen-duplicaties en complexe transcriptieregulatie omvat.