A Fragment Screen Identifies Acrylamide Covalent Inhibitors of the TEAD/YAP Protein-Protein Interaction

In deze studie wordt een fragmentscreen uitgevoerd om acrylamide-gebaseerde covalente remmers te identificeren die de TEAD/YAP-proteïne-interactie via een allosterisch mechanisme in de palmitaatpocket van TEAD-proteïnes verstoren.

De kern

🧬 De Sleutel, het Slot en de "Vaste" Lijm

Stel je voor dat het menselijk lichaam een enorme stad is. In deze stad zijn er bouwmeesters (eiwitten) die beslissen welke gebouwen worden opgetrokken. Een van de belangrijkste bouwmeesters heet TEAD. Om een gebouw te bouwen, moet TEAD samenwerken met een assistent genaamd YAP.

In een gezonde stad werken ze alleen samen als het nodig is. Maar in kanker is dit systeem kapot. TEAD en YAP blijven elkaar vastklampen, ook als het niet moet. Hierdoor worden er steeds meer "kankergebouwen" (tumoren) opgetrokken.

Het probleem:
De plek waar TEAD en YAP elkaar vasthouden, is erg glad en heeft geen gaatjes of gleuven. Het is alsof je twee gladde stenen probeert te scheiden; er is geen handvat om aan te trekken. Wetenschappers noemen dit een "onbehandelbaar" doelwit.

De oplossing:
Maar gelukkig heeft TEAD nog een ander kenmerk: hij heeft een diep, donker holletje in zijn zijde (de "palmitaat-pocket"). Dit holletje is normaal gesproken gevuld met een vetje (palmitaat) dat TEAD stabiel houdt. Dit holletje is wél toegankelijk voor medicijnen.

🔨 De Missie: Een Vaste Lijm Vinden

De onderzoekers in dit artikel wilden een medicijn maken dat in dat holletje past. Maar ze wilden niet zomaar een medicijn dat losjes vastzit. Ze wilden een covalente remmer.

• De analogie: Stel je voor dat je een sleutel in een slot doet. Een normaal medicijn is een sleutel die je erin stopt en weer uittrekt. Een covalent medicijn is een sleutel die je erin stopt en die op zijn plaats wordt gelijmd. Zodra hij erin zit, kan hij er nooit meer uit.

Ze gebruikten een speciale "lijm" genaamd acrylamide. Dit is een chemisch groepje dat als een haakje werkt dat zich vasthakt aan een speciaal haakje in het eiwit (een cysteïne-molecuul).

🔍 De Zoektocht: De Fragmentjacht

De onderzoekers hadden een enorme doos met 372 kleine bouwstenen (fragmenten). Ze gooiden deze één voor één in een bak met TEAD-eiwitten om te zien welke erin bleven zitten en of ze de samenwerking met YAP konden stoppen.

• Het resultaat: De meeste bouwstenen vielen er gewoon weer uit of werkten niet. Maar ze vonden er twee die echt werkten: Fragment 1 en Fragment 2.
• De test: Ze maakten een mutant van TEAD waarbij het haakje (cysteïne) was verwijderd. De goede bouwstenen werkten daar niet meer op. Dit bewees dat ze zich echt vasthaken aan dat specifieke haakje.

🛠️ Verbeteren: Van Houten Kistje tot Stalen Slot

De eerste bouwsteen (Fragment 1) werkte, maar niet perfect. Het was een beetje wankel. De onderzoekers gingen aan de slag om het te verbeteren. Ze maakten een paar variaties, alsof ze een houten kistje vervormden tot een strakke stalen doos.

Een van de nieuwe versies, genaamd 14 (ACR-374), was een echte winnaar:

1. Sneller: Het hakte zich veel sneller vast dan het origineel.
2. Selectiever: Het werkte heel goed op TEAD1 en TEAD3, maar minder goed op TEAD2 en TEAD4.

🔬 De X-ray Foto's: Wat gebeurt er precies?

Om te zien hoe dit precies werkt, maakten ze foto's met röntgenstralen (kristallografie). Dit is alsof je een 3D-foto maakt van de sleutel in het slot.

• Verrassing: Ze zagen dat het medicijn in het ene eiwit (TEAD2) op de ene manier zat, en in het andere eiwit (TEAD3) op een heel andere manier.
• De les: In TEAD3 paste het medicijn precies in het holletje, net als het oorspronkelijke vetje. In TEAD2 zat het wat scheef. Dit verklaarde waarom het medicijn op de ene versie van TEAD veel beter werkte dan op de andere. Het is alsof een sleutel perfect past in de voordeur, maar net iets te groot is voor de achterdeur.

🎭 Het Grote Geheim: De "Allosterische" Toverstaf

Het meest fascinerende deel is waarom dit werkt. Het medicijn zit in een holletje aan de zijkant, maar het stopt de samenwerking tussen TEAD en YAP die aan de voorkant gebeurt.

• De analogie: Stel je voor dat TEAD een poppetje is. Je pakt het poppetje bij de voet (het holletje) en duwt daar een speld in. Door die duw aan de voet, verandert de houding van het hele poppetje. De handen (waar YAP vastzit) gaan vanzelf uit elkaar.
• Dit noemen ze allostere remming: een verandering op de ene plek die een effect heeft op een heel andere plek. Het medicijn verandert de vorm van TEAD zodat YAP er niet meer bij kan.

🏁 Conclusie: Een Nieuwe Weg voor Kankerbehandeling

De onderzoekers hebben bewezen dat je kanker kunt bestrijden door een kleine, chemische "lijm" in een diep holletje van een eiwit te stoppen.

• Waarom is dit belangrijk? Omdat de plek waar TEAD en YAP samenkomen onbereikbaar is, hebben we deze "achterdeur" nodig.
• De toekomst: Deze kleine bouwstenen zijn het begin. De onderzoekers hopen dat ze hier nog sterkere en betere medicijnen van kunnen maken die kankercellen kunnen stoppen door TEAD en YAP voor altijd uit elkaar te houden.

Kort samengevat: Ze vonden een manier om een onbereikbaar doelwit te raken door een chemische haak in een verborgen holletje te zetten, waardoor het hele systeem uit elkaar valt. Een slimme truc met een beetje "vaste lijm"!

Technische samenvatting

Titel: Een fragmentscreen identificeert acrylamide covalente remmers van de TEAD•YAP eiwit-eiwit interactie

1. Het Probleem

De Hippo-signaalweg speelt een cruciale rol in de regulatie van celgroei en metastase. In kanker is deze weg vaak uitgeschakeld, wat leidt tot de translocatie van de co-activatoren YAP (Yes-associated protein) en TAZ naar de kern. Daar vormen ze een complex met TEAD-transcriptiefactoren (TEAD1-4), wat de expressie van tumorgeneesmiddelen (zoals CTGF, MYC, PD-L1) activeert.

• De uitdaging: De interactie tussen TEAD en YAP is een groot, plat interface zonder goed gedefinieerde bindingszakken, waardoor deze klassiek als "on-druggable" (niet te remmen met kleine moleculen) wordt beschouwd.
• De kans: TEAD-eiwitten bezitten echter een unieke, diepe palmitaat-bindingszak die zich buiten het TEAD•YAP-interactieinterface bevindt. Deze zak bevat een sterk geconserveerd cysteïne-residu (Cys367 in TEAD4) dat een thioester-binding vormt met palmitaat. Het doel is om allosterische remmers te ontwikkelen die in deze zak binden en de TEAD•YAP-interactie verstoren.

2. Methodologie

De auteurs hanteerden een gefaseerde aanpak om covalente fragmenten te identificeren en te optimaliseren:

• Fragmentscreening: Een bibliotheek van 372 acrylamide-elektrofielen (warheads) werd gescreend op remming van de TEAD4•YAP-interactie met behulp van een fluorescentie-polarisatie (FP) assay.
• Validatie van covalente binding: Hits werden getest op hun vermogen om de TEAD4C367S-mutant (waar het nucleofiele cysteïne is verwijderd) te remmen. Alleen verbindingen die specifiek het wildtype remden en de mutant niet, werden beschouwd als covalente remmers.
• Massaspectrometrie: Hele-eiwit massaspectrometrie werd gebruikt om de vorming van covalente adducten te bevestigen en de exacte massa-toename te kwantificeren.
• Kinetische studies: Tijd- en concentratie-afhankelijke experimenten werden uitgevoerd om de inactivatieconstante ($k_{inact}$), de bindingsconstante ($K_I$) en de tweede-orde snelheidsconstante ($k_{inact}/K_I$) te bepalen voor alle vier TEAD-isoformen.
• Kristallografie: Co-crystalstructuren van TEAD2 en TEAD3 in complex met de leidende fragmenten werden opgelost om de bindingsmodi en interacties in de palmitaatzak te visualiseren.
• Mutatiestudies: Specifieke mutaties in de lipidezak (F393A en F415A in TEAD4) werden gemaakt om de allosterische mechanismen te testen.

3. Belangrijkste Bijdragen en Resultaten

Identificatie van Hits:

• Van de 372 fragmenten identificeerden de auteurs twee hits (1 en 2) die specifiek het wildtype TEAD4 remden en geen effect hadden op de C367S-mutant, wat bevestigde dat de remming afhankelijk was van covalente binding aan het palmitaat-cysteïne.
• Fragment 1 (ACR-021) bleek de meest veelbelovende leidende structuur te zijn met een $IC_{50}$ van 4,6 µM voor TEAD4.

Synthese en SAR (Structure-Activity Relationship):

• Er werden vier derivaten van ACR-021 gesynthetiseerd (14-17) om de structuur te optimaliseren.
• Compound 14 (ACR-374) toonde de beste prestaties. Het had een $k_{inact}/K_I$ van 128 $M^{-1}s^{-1}$ voor TEAD3 en 24,2 $M^{-1}s^{-1}$ voor TEAD1, wat aanzienlijk beter was dan de ouderstructuur.
• Er werd een opvallende selectiviteit waargenomen: de verbindingen remden TEAD1 en TEAD3 zeer effectief, maar hadden weinig tot geen effect op TEAD2 en TEAD4 bij lagere concentraties, ondanks de hoge sequentie-identiteit in de bindingszak.

Kristalstructuren en Bindingsmodi:

• TEAD2: In de kristalstructuur van TEAD2 gebonden aan 14 (ACR-374) werd een ongebruikelijke binding waargenomen. In monomeer A reageerde het fragment met Cys-380, terwijl het in monomeer B reageerde met Cys-343 (een minder geconserveerd cysteïne dichter bij het interface). Het trifluoromethyl-fenyl-gedeelte bezette de "middelste" en "onderste" sub-zakken.
• TEAD3: In TEAD3 nam het fragment een bindingsmodus aan die de native palmitaat-binding nabootste. Het bezette de "onderste" sub-zak volledig, wat leidde tot een zeer snelle reactiesnelheid ($t_{1/2}$ in minuten).
• Mechanisme: De verschillen in bindingsmodi tussen TEAD2 en TEAD3 (veroorzaakt door subtiele verschillen in residuen zoals Leu-383 vs. Met-371 en Phe-233 vs. Tyr-230) verklaren de grote verschillen in remmingspotentie.

Allosterisch Mechanisme:

• Mutatie-experimenten (F393A en F415A in TEAD4) toonden aan dat het verstoren van de interactie tussen het kleine molecuul en specifieke vetzuurzak-residuen de remming versterkte. Dit ondersteunt het hypothese dat binding in de palmitaatzak lokale conformatieveranderingen induceert die de affiniteit voor YAP verlagen (allosterische remming).
• De tijdsschaal van de remming (gemeten via FP) kwam overeen met de reactietijd (gemeten via MS), wat suggereert dat de conformatieveranderingen snel plaatsvinden na de covalente binding.

4. Betekenis en Conclusie

• Nieuwe Startpunt: Dit onderzoek levert een nieuw acrylamide-fragment (ACR-021) en geoptimaliseerde derivaten (zoals ACR-374) die dienen als startpunt voor de ontwikkeling van covalente TEAD•YAP-remmers.
• Inzicht in Allosterie: De studie demonstreert dat covalente remming van een distale cysteïne in de palmitaatzak effectief de TEAD•YAP-interactie kan verstoren via een allosterisch mechanisme.
• Selectiviteit en Strategie: De bevindingen tonen aan dat subtiele verschillen in de bindingszak van TEAD-isoformen leiden tot drastisch verschillende bindingsmodi en kinetische profielen. Dit suggereert dat toekomstige optimalisatie zich moet richten op het maximaliseren van de reactiesnelheid ($k_{inact}$) en het benutten van de specifieke sub-zakken (centraal en boven) om potentie en selectiviteit te verhogen.
• Therapeutisch Potentieel: Covalente remmers bieden een voordeel boven niet-covalente remmers voor allosterische doelen, omdat ze zelfs met lagere bindingsaffiniteit hoge potentie kunnen bereiken door de irreversibele reactiestap. Dit maakt ze veelbelovend voor de behandeling van kankers die afhankelijk zijn van de Hippo/YAP-pad.

Samenvattend biedt dit werk een robuust chemisch en structureel fundament voor het ontwerpen van de volgende generatie TEAD-remmers die specifiek gericht zijn op het verstoren van de oncogene TEAD•YAP-interactie.