Drug repurposing high-throughput screen identifies candidate antiviral compounds against Puumala Orthohantavirus

In deze studie werd via een high-throughput drug repurposing screen 70 kandidaat-antivirale verbindingen geïdentificeerd die Puumala-orthohantavirus-infectie remmen, waaronder bekende remmers van gastheerpaden en nieuwe antibiotica, wat een systematisch overzicht biedt van gastheerprocessen die voor verdere onderzoeken in aanmerking komen.

De kern

Stel je voor dat het Puumala-virus (een soort hantavirus) een sluwe inbreker is die zich in je lichaam nestelt. In Europa veroorzaakt dit virus een ziekte die de nieren aantast, maar er is nog geen medicijn dat specifiek tegen deze inbreker werkt. Artsen kunnen alleen de symptomen verzorgen, alsof ze de ramen dichten nadat de inbreker al binnen is geweest.

De onderzoekers van dit artikel wilden een nieuwe aanpak proberen. In plaats van een nieuw medicijn te ontwerpen van nul af aan (wat jaren duurt), besloten ze te kijken in de medicijnkast van de wereld: bestaande medicijnen die al veilig zijn voor mensen, maar voor andere ziektes worden gebruikt. Dit noemen ze "drug repurposing" of het hergebruiken van medicijnen.

Hier is hoe ze te werk gingen, vertaald in alledaagse taal:

1. De Grote Zoektocht (Het Experiment)

Stel je voor dat je een enorme bibliotheek hebt met 5.256 verschillende medicijnen. De onderzoekers wilden weten: "Welke van deze medicijnen kan deze specifieke virus-inbreker stoppen?"

Ze gebruikten twee soorten "testkamers" (celletjes):

• A549-cellen: Een standaard laboratoriumcel (als een proefkonijn).
• HUVEC-cellen: Dit zijn echte cellen uit de wanden van bloedvaten. Omdat hantavirussen zich graag in bloedvaten nestelen, was dit de echte "criminele locatie".

Ze lieten het virus los in deze kamers en gaven er vervolgens een willekeurig medicijn bij. Vervolgens keken ze door een superkrachtige microscoop: Is het virus nog steeds aan het werk, of is het gestopt?

2. De Verrassende Winnaars

Na het testen van duizenden medicijnen vonden ze 70 winnaars die het virus echt konden stoppen. Het was alsof ze in een berg met oude gereedschappen zaten en plotseling ontdekten dat een oude hamer, een schroevendraaier en zelfs een oude tandenborstel perfect werkten om de deur van de inbreker dicht te houden.

De onderzoekers ontdekten drie interessante groepen:

• De "Voedsel-afsnijders" (Nucleotide-inhibitors): Virussen hebben bouwstenen nodig om zich te vermenigvuldigen. Sommige medicijnen (zoals IMPDH-remmers) snijden de toevoer van deze bouwstenen af. Het is alsof je de inbreker de sleutelkast afsluit; hij kan niet meer naar binnen of verder bouwen.
• De "Stress-managers" (HSP-remmers): Virussen maken gebruik van de "hulpdiensten" van de cel (zoals warmte-schok-eiwitten) om hun eigen bouwplannen te maken. Sommige medicijnen blokkeren deze hulpdiensten. Zonder hulp kan het virus zijn werk niet afmaken.
• De "Onverwachte Heldjes" (Antibiotica): Dit was de grootste verrassing! Ze vonden dat bepaalde antibiotica (die normaal gesproken bacteriën doden, geen virussen) ook het virus konden stoppen. Het is alsof je ontdekt dat een middel tegen een mierenplaag ook perfect werkt tegen een muizenplaag. Dit was nog nooit eerder gezien voor dit virus.

3. De "Pro-virus" Verrassing

Niet alles was positief. Ze vonden ook 21 medicijnen die het virus juist helpen om zich sneller te vermenigvuldigen. Dit was vooral zichtbaar in de standaard-cellen. Het is alsof je een medicijn geeft dat de inbreker juist extra energie geeft. Dit is belangrijk om te weten, zodat artens die medicijnen niet per ongeluk geven als iemand besmet is.

4. Waarom is dit belangrijk?

Dit onderzoek is als het vinden van een nieuwe schatkaart.

• Het laat zien dat we niet altijd nieuwe medicijnen hoeven te uitvinden; soms zitten de oplossingen al in de kast.
• Het laat zien dat het virus afhankelijk is van de "huishoudelijke taken" van onze eigen cellen. Als we die taken verstoren, stopt het virus.
• Het geeft artens en wetenschappers een lijst met kandidaten die ze nu verder kunnen testen. Misschien kunnen we binnenkort een bestaand antibioticum of een bestaand medicijn tegen een andere ziekte gebruiken om hantavirus-patiënten te redden.

Kortom: De onderzoekers hebben een slimme, snelle manier gevonden om te kijken welke oude medicijnen een nieuwe vijand (het hantavirus) kunnen verslaan. Ze vonden dat sommige medicijnen die we al kennen, verrassend goed werken, en dat geeft hoop voor een toekomst zonder zware ziekte.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Orthohantavirussen zijn zoönotische negatief-gestrengde RNA-virussen die door knaagdieren worden overgedragen en twee ernstige menselijke ziektes veroorzaken: het hemorragische koorts met renaal syndroom (HFRS) en het hantavirus longsyndroom (HPS). Hoewel HFRS in Europa (voornamelijk veroorzaakt door het Puumala-virus, PUUV) een relatief lage sterftecijfer heeft, is HPS in de Amerika's dodelijk (30-40% sterfte).
Er is momenteel geen goedgekeurd antiviraal medicijn of vaccin beschikbaar voor hantavirusinfecties; de behandeling beperkt zich tot symptomatische zorg. Bestaande onderzoekspogingen hebben vaak gefaald in klinische settings of zich gericht op pseudotyped virussen en specifieke infectiefasen, waardoor ze geen volledig beeld geven van de gastheer-afhankelijkheden tijdens een productieve, levende virusinfectie.

Methodologie

De auteurs hebben een high-throughput fenotypische screening ontwikkeld om gastheer-gestuurde modulatoren van PUUV-infectie te identificeren via drug repurposing.

1. Assay-ontwikkeling:

   • Er werd een geautomatiseerd immunofluorescentie-microscopie-assay opgezet in A549-cellen (menselijke longepitheelcellen).
   • Het protocol werd geoptimaliseerd voor automatisering: de infectieprotocollen werden vereenvoudigd (virus direct toevoegen zonder wassen) en de virusdosis werd geoptimaliseerd.
   • De assay toonde een hoge reproduceerbaarheid met een Z'-factor van 0,7 en een signaal-ruisverhouding (S/N) van 42.
   • Infectie werd gemeten als de verhouding tussen virus-positieve cellen (gekleurd met antilichamen tegen virale eiwitten) en het totale aantal cellen.

2. Screening:

   • Er werd gescreend tegen de Drug Repurposing Hub-library, bestaande uit 5.256 FDA-goedgekeurde, klinische en preklinische geneesmiddelen.
   • A549-cellen werden in 384-wells platen uitgezaaid met de verbindingen (10 µM), gevolgd door infectie met PUUV.
   • Na 24 uur werden de cellen gefixeerd, gekleurd en geanalyseerd met high-content microscopy (IN Cell Analyzer 2200) en beeldanalyse-software (CellProfiler).
   • Hit-criteria: Een verbinding werd als "hit" beschouwd als deze de infectiegraad met minstens 2-voud verlaagde (antiviraal) of verhoogde (proviraal), terwijl de celviabiliteit maximaal met 50% afnam.

3. Validatie:

   • De primaire hits werden gevalideerd in A549-cellen en HUVECs (primaire menselijke umbilicale veneuze endotheelcellen), omdat hantavirussen primair endotheelcellen infecteren.
   • Validatie vond plaats bij drie verschillende doses (0,83 µM, 2,5 µM en 10 µM).
   • Functionele clustering werd uitgevoerd om verbindingen te groeperen op basis van hun geannoteerde doelen en werkingsmechanismen.

Belangrijkste Resultaten

• Identificatie van hits: Uit de screening van 5.256 verbindingen kwamen 150 kandidaat-antivirale en 25 kandidaat-provirale verbindingen naar voren die de initiële drempels haalden.
• Validatie: Na validatie in beide celtypen werden 70 antivirale verbindingen bevestigd.
  • 36 waren actief in zowel A549 als HUVEC.
  • 24 waren specifiek voor A549.
  • 10 waren specifiek voor HUVEC.
• Functionele Clustering van Antivirale Hits: De bevestigde antivirale middelen clusterden rond bekende en nieuwe mechanismen:
  • IMPDH-remmers: Remmers van inosine monofosfaat dehydrogenase (nucleotide synthese) waren zeer effectief in beide celtypen, wat bevestigt dat nucleotidebeschikbaarheid cruciaal is voor hantavirusreplicatie.
  • mTOR-remmers: Deze toonden sterke antivirale activiteit, maar waren vooral effectief in A549-cellen, wat suggereert dat de impact van mTOR-modulatie afhangt van het celtype.
  • HSP90-remmers: Remmers van heat shock protein 90 (HSP90) werden geïdentificeerd, wat wijst op een rol van proteostase in de infectie.
  • Antibiotica: Opvallend genoeg werden diverse beta-lactam-antibiotica geïdentificeerd als effectieve antivirale middelen. Dit is een nieuwe bevinding, aangezien deze klasse niet klassiek met antivirale effecten wordt geassocieerd.
• Provirale Hits: 21 verbindingen verhoogden de infectiegraad in A549-cellen. Deze clusterden sterk rond epigenetische modulatoren, met name remmers van histon deacetylase (HDAC-remmers). Dit suggereert dat chromatinestatus een rol kan spelen in de restrictie of reactivatie van hantavirusinfectie.
• Celtype-specifiteit: De infectiegraad was aanzienlijk hoger in HUVECs (80%) dan in A549-cellen (20%), wat het analyseren van provirale effecten in HUVECs bemoeilijkte.

Bijdragen en Significance

1. Systematische Kaart van Gastheer-afhankelijkheden: Dit onderzoek biedt de eerste systematische kaart van gastheerpaden die PUUV-infectie beïnvloeden, gebaseerd op een live-virus screening in plaats van pseudotyped virussen.
2. Validatie van Bestaande Kennis: De resultaten bevestigen de rol van bekende paden zoals nucleotide synthese (IMPDH), mTOR-signaleren en HSP-functie in hantavirusreplicatie.
3. Nieuwe Therapeutische Kansen:
   • De identificatie van beta-lactam-antibiotica als potentieel antiviraal middel is een doorbraak die verdere mechanistische studie vereist.
   • Het vinden van specifieke effecten in endotheelcellen (HUVECs) versus longepitheelcellen (A549) benadrukt het belang van het testen in relevante celtypen voor hantavirussen.
4. Repurposing Potentieel: De dataset levert een lijst van reeds goedgekeurde of klinisch geteste geneesmiddelen die direct kunnen worden doorgestuurd naar preklinische diermodellen voor de behandeling van HFRS en HPS.
5. Inzicht in Persistentie: De bevinding dat HDAC-remmers de infectie kunnen versterken, biedt nieuwe hypotheses over hoe hantavirussen persistente infecties kunnen vestigen en hoe chromatinestatus dit beïnvloedt.

Concluderend biedt deze studie een robuust raamwerk voor het prioriteren van gastheerpaden voor toekomstig mechanistisch onderzoek en opent het de deur naar snelle therapeutische interventies via drug repurposing voor een ziekte waarvoor momenteel geen specifieke behandeling bestaat.