AI-Enforced Ultra-Large Virtual Screening Discovers Potent CD28 Binders

Dit onderzoek valideert het AI-gestuurde PyRMD2Dock-platform als een effectieve methode voor het ontdekken van krachtige, submicromolaire kleine moleculen die de uitdagende eiwit-eiwitinteractie van CD28 succesvol blokkeren, wat resulteert in een hoge hit-rate en functionele onderdrukking van cytokinesecretie.

De kern

🕵️‍♂️ De Grote Digitale Schatzoeker: Hoe AI een onmogelijke sleutel vond

Stel je voor dat je een enorme sleutelkast hebt met 48 miljoen verschillende sleutels. Je doel is om één specifieke sleutel te vinden die op een heel lastig slot past. Dit slot is niet zoals een gewone deur met een diep sleutelgat. Nee, dit slot is plat, glad en zit vol met water (het is een eiwit in ons lichaam dat 'CD28' heet).

In de wereld van medicijnen is het vinden van een klein molecuul (een 'sleutel') dat op zo'n plat, glad oppervlak past, als proberen een sleutel te maken voor een muur. Normaal gesproken zou je elke sleutel één voor één proberen, maar dat zou duizenden jaren duren.

Wat hebben deze onderzoekers gedaan?
Ze hebben een slimme, kunstmatige intelligentie (AI) ingezet die fungeert als een super-schatzoeker. Ze noemen hun systeem PyRMD2Dock. Laten we kijken hoe dit werkt, stap voor stap.

1. De Proef en de Leraar (Het Trainen van de AI)

Eerst namen ze een klein, gevarieerd stukje van die 48 miljoen sleutels (2,4 miljoen stuks) en probeerden ze die allemaal op het slot te passen met een computerprogramma.

• De Analogie: Stel je voor dat je een hond traint om te jagen. Je laat de hond eerst 2,4 miljoen verschillende dieren zien. Sommige dieren zijn prooi (goede sleutels), andere zijn niet interessant (slechte sleutels). De hond leert: "Als het dier deze vorm heeft, is het waarschijnlijk prooi."
• In dit geval leerde de AI welke chemische vormen goed op het CD28-slot pasten en welke niet.

2. De Grote Jacht (Het Screenen)

Nu de AI 'slim' was geworden, liet men hem de rest van de 48 miljoen sleutels bekijken.

• De Analogie: In plaats van dat de AI elke sleutel fysiek probeert (wat te lang zou duren), kijkt hij alleen naar de vorm en zegt: "Die lijkt op de prooi, die niet."
• Dankzij deze slimme truc kon de AI in een paar dagen doen wat normaal jaren zou duren. Hij filterde de 48 miljoen sleutels door en hield er 232 over die de beste kans hadden om te werken.

3. De Echte Test (In het Laboratorium)

De onderzoekers kochten 150 van die 232 veelbelovende sleutels en brachten ze naar het echte laboratorium.

• Het Resultaat: Het was een enorme succes! Van de 150 geteste sleutels bleken er 12 echt te werken. Dat is een heel hoog percentage (meestal is dat maar 1 op de 1000).
• Twee sleutels, genaamd 100 en 104, waren de sterren van de show. Ze pasten zo perfect dat ze het slot (CD28) op slot konden doen.

4. Wat doen deze sleutels eigenlijk?

CD28 is een "aan/uit-knop" op onze immuuncellen. Normaal gesproken helpt deze knop het lichaam om te vechten tegen kanker. Maar soms is die knop te druk aan het werk, wat leidt tot auto-immuunziektes of onnodige ontstekingen.

• De Analogie: Stel je voor dat CD28 een drukke brandweerman is die per ongeluk te vaak de brandblussers uitrolt. De nieuwe medicijnen (sleutels 100 en 104) werken als een veilige handrem. Ze houden de brandweerman vast zodat hij niet per ongeluk de verkeerde blusactie start.
• In tests met menselijke cellen (in een soort mini-tumor en longweefsel) zagen ze dat deze medicijnen de ontstekingen (cytokines) echt stopten. Het was alsof ze de ruzie tussen de cellen konden stilleggen.

5. Waarom is dit zo speciaal?

Vroeger dachten wetenschappers dat je geen medicijnen kon maken voor zulke platte, gladde oppervlakken. Het was als zeggen: "Je kunt geen sleutel maken voor een gladde muur."

• De conclusie: Dit onderzoek bewijst dat je het wel kunt, als je slimme AI gebruikt om de juiste vorm te vinden. Het opent de deur voor medicijnen tegen ziektes die voorheen ongeneeslijk leken.

Samenvatting in één zin:

De onderzoekers gebruikten een slimme AI om uit een berg van 48 miljoen mogelijke medicijnen de twee beste "sleutels" te vinden die een lastig, plat immuunsysteem-slot kunnen blokkeren, wat een nieuwe weg opent voor het behandelen van complexe ziektes.

Kortom: AI heeft bewezen dat je ook de moeilijkste puzzels kunt oplossen als je maar genoeg rekenkracht en slimme strategieën gebruikt! 🧩🤖✨

Technische samenvatting

Probleemstelling

Het ontwikkelen van kleine moleculen die eiwit-eiwitinteracties (PPI's) kunnen targeten, is historisch gezien een enorme uitdaging in de computergestuurde drugontwikkeling. In tegenstelling tot enzymen met diepe, goed gedefinieerde bindingszakken, hebben PPI-oppervlakken vaak brede, oplosmiddel-blootgestelde en topografisch ondiepe interfacegebieden.

Een specifiek voorbeeld van zo'n moeilijk target is de kostimulatieve immuunreceptor CD28. CD28 is een homodimeer dat zijn liganden (CD80 en CD86) bindt via een grotendeels vlak en oplosmiddel-blootgesteld oppervlak zonder diepe recessies. Dit gebrek aan een klassieke "druggable" pocket maakt het zeer moeilijk om kleine moleculen te vinden die deze interactie effectief kunnen verstoren. Bovendien imposeert het screenen van ultra-grote chemische ruimtes (miljarden verbindingen) met traditionele structuur-gebaseerde virtuele screening (SBVS) methoden onaanvaardbare computertijd en kosten.

Methodologie

De auteurs rapporteren de eerste prospectieve, real-world toepassing van het PyRMD2Dock-platform, een AI-gedreven SBVS-workflow geïntegreerd in de PyRMD Studio-suite. De aanpak combineerde machine learning (ML) met high-performance docking om de rekenkundige bottleneck te omzeilen.

De workflow bestond uit de volgende stappen:

1. Selectie van het bindingsgebied: In plaats van het canonieke bindingsgebied (MYPPPY-motief), dat te plat is, werd een aangrenzende, subtielere groef geselecteerd. Deze pocket wordt begrensd door de aminozuren H38, F93, K95, D106, N107, K109 en S110. De keuze werd onderbouwd door structurele alignering met CTLA-4 en de bindingsplaats van het antilichaam tremelimumab.
2. Training van het ML-model:
   • Een chemisch diverse subset van 2,4 miljoen moleculen uit de Enamine REAL Diversity Space werd geselecteerd en gedocked in de CD28-structuur (PDB ID: 1YJD) met behulp van AutoDock-GPU (AD4-GPU).
   • Op basis van de docking-scores ($\Delta G_{AD4}$) werden de verbindingen geclassificeerd als "actief" of "inactief" met verschillende drempelwaarden.
   • Er werden 672 classificatiemodellen getraind en geoptimaliseerd door variatie in activiteitsdrempels en $\epsilon$-cutoff-waarden. Het beste model werd geselecteerd op basis van een optimale balans tussen True Positive Rate (TPR), False Positive Rate (FPR), precisie en F-score.
3. Ultra-large Virtual Screening:
   • Het geoptimaliseerde PyRMD-model werd gebruikt om de resterende ~46 miljoen verbindingen uit de Enamine REAL Diversity Set (ERDS) te screenen zonder expliciete docking voor elke verbinding.
   • Dit resulteerde in een eerste selectie van ~20 miljoen potentiële binders, die vervolgens werden gefilterd op basis van docking-scores en interactie-eisen (specifiek contact met residuen K109 en C94).
4. Filtratie en Clustering:
   • Na verdere filtering op bindingsenergie ($\le -7,75$ kcal/mol) en interactiepatronen, bleven er ~94.000 verbindingen over.
   • Deze werden onderworpen aan een SASA-analyse (Solvent Accessible Surface Area) en clustering om chemische diversiteit te waarborgen.
   • Uiteindelijk werden 232 hoog-prioritaire liganden geselecteerd voor experimentele validatie.

Belangrijkste Resultaten

Van de 232 geselecteerde verbindingen werden 150 gekocht en experimenteel getest. De resultaten waren opmerkelijk succesvol:

• Hit-rate: Uit de 150 geteste verbindingen werden 12 primaire hits geïdentificeerd met een hit-rate van ongeveer 7,3% in de eerste screeningsfase.
• Bindingsaffiniteit (MST): Twee leidverbindingen, 100 en 104, toonden een sub-micromolaire affiniteit voor CD28, gemeten met Microscale Thermophoresis (MST):
  • Cpd 100: $K_d = 343,8$ nM
  • Cpd 104: $K_d = 407,1$ nM
• Competitieve Remming (ELISA): Deze verbindingen verstoorden succesvol de interactie tussen CD28 en CD80. Cpd 100 had een $IC_{50}$ van 231,4 nM en Cpd 104 van 840,6 nM.
• Functionele Blokkade: In celgebaseerde reporter assays (Jurkat-cellen) blokkeerden beide verbindingen de CD28-gemedieerde signalering met $IC_{50}$-waarden in het sub-micromolaire bereik.
• Fysiologische Validatie:
  • In een 3D co-cultuurmodel (tumor-sferoïden + PBMC's) reduceerden de verbindingen de secretie van cytokinen (IFN-$\gamma$, IL-2) en de expressie van CD69, wat aantoont dat ze T-cel-activatie effectief remmen.
  • In een menselijk luchtweg-epitheel co-cultuurmodel (MucilAir™) toonde Cpd 100 eveneens potent remmende activiteit, vergelijkbaar met de klinische referentie FR104.
• Bindingsmode: Computergestuurde analyse toonde aan dat Cpd 100 en 104, hoewel ze tot verschillende clusters behoren, convergente interactiepatronen vertonen met dezelfde aminozuurresiduen (zoals K109, K95, H38), maar in verschillende oriëntaties binnen de pocket.

Bijdragen en Significatie

Deze studie levert een aantal cruciale bijdragen aan het veld van de computergestuurde geneesmiddelenontwikkeling:

1. Validatie van AI-gedreven Ultra-Large Screening: Het bewijst dat het PyRMD2Dock-platform een schaalbare en effectieve methode is om miljarden verbindingen te screenen voor moeilijke targets, waarbij ML wordt gebruikt om de dure docking-berekeningen te omzeilen.
2. Doorbraak bij CD28: Het is een van de eerste succesvolle voorbeelden van het vinden van kleine moleculen die de vlakke, solvent-blootgestelde interface van CD28 direct binden en verstoren. Dit opent nieuwe mogelijkheden voor immunotherapieën.
3. Prospectieve Real-World Applicatie: In tegenstelling tot veel retrospectieve studies, werd deze workflow prospectief toegepast: van computervolgorde tot aankoop en experimentele validatie van nieuwe chemotypes.
4. Schaalbaarheid en Democratisering: De PyRMD Studio-suite democratiseert geavanceerde AI-workflows, waardoor onderzoekers zonder uitgebreide programmeerkennis complexe SBVS-taken kunnen uitvoeren.

Conclusie:
De studie demonstreert dat AI-gedreven, ultra-grote virtuele screening succesvol kan worden ingezet om structureel veeleisende immuunreceptor-interfaces te targeten. De ontdekking van de potent CD28-antagonisten 100 en 104 valideert niet alleen het PyRMD2Dock-protocol, maar biedt ook een nieuwe route voor het ontwikkelen van kleine moleculen tegen complexe PPI's die eerder als "onmogelijk" werden beschouwd.