In-source fragmentation in mass spectrometry-based proteomics: prevalence, impact, and strategies for mitigation

Dit artikel beschrijft een open-source methode om in-source fragmentatie (ISF) in massaspectrometrie-gebaseerde proteomica te detecteren en te mitigeren, een veelvoorkomend fenomeen dat leidt tot misinterpretatie van data en kunstmatige peptide-identificaties, met name in peptide-gedreven toepassingen zoals immunopeptidomica.

De kern

Titel: De 'Geestelijke' Peptiden: Waarom je soms ziet wat er niet is in je eiwitanalyse

Stel je voor dat je een enorme, complexe soep aan het koken bent. Deze soep bevat duizenden verschillende ingrediënten (eiwitten) die je eerst in kleine stukjes hebt gesneden (peptiden). Je wilt precies weten welke ingrediënten erin zitten en hoeveel er van elk zijn. Hiervoor gebruik je een supergeavanceerde scanner (een massaspectrometer) die elk stukje één voor één scant.

Maar er is een probleem: tijdens het scannen, net voordat de scanner de stukjes 'leest', gebeuren er soms kleine ongelukjes in de machine. Een groot stukje eiwit breekt per ongeluk af in een kleiner stukje. Dit noemen de auteurs In-Source Fragmentatie (ISF).

Het probleem is dat de scanner dit kleine, afgebroken stukje ziet en denkt: "Oh, dit is een echt, natuurlijk stukje eiwit dat in de soep zat!" Terwijl het in feite slechts een kunstmatig restje is van een groter stuk dat net is gebroken.

Het probleem: Verkeerde identificatie

In het verleden was dit niet zo'n groot probleem. De meeste onderzoekers keken alleen naar de grote, volledige stukken (de 'volledige' eiwitten). Als er een klein, gebroken stukje in de scanner verscheen, werd het vaak genegeerd of geteld als een foutje.

Maar de wetenschap is veranderd. Vandaag de dag kijken onderzoekers steeds vaker naar:

1. Kleine stukjes: Bijvoorbeeld in immunologie, waar het immuunsysteem heel kleine stukjes eiwitten (peptiden) herkent.
2. Specifieke modificaties: Waar eiwitten kleine 'stickers' (zoals fosfaatgroepen) hebben gekregen.

In deze situaties is het een ramp als de scanner denkt dat een gebroken stukje een echt biologisch stukje is. Het is alsof je in je soep een stukje wortel ziet, maar het is eigenlijk alleen maar een stukje aardappel dat per ongeluk is afgebroken van een grotere aardappel. Je zou dan denken: "Ah, er zit wortel in!", terwijl er helemaal geen wortel in zit. Dit leidt tot verkeerde conclusies.

De oplossing: De 'Tijdsynchronisatie'-detectie

De auteurs van dit paper hebben een slimme manier bedacht om deze 'geestelijke' stukjes op te sporen. Ze gebruiken een heel simpel principe: tijd.

Stel je voor dat je twee mensen hebt die door een tunnel lopen:

• De Ouder (het grote eiwit): Loopt langzaam door de tunnel.
• Het Kind (het gebroken stukje): Loopt ook door de tunnel, maar is kleiner.

Normaal gesproken zou een kleiner persoon sneller door de tunnel gaan. Maar hier is de truc: het 'Kind' is pas ontstaan op het moment dat ze de tunnel binnenkwamen. Ze hebben dus precies hetzelfde tijdstip als de 'Ouder' om de tunnel in te lopen. Ze komen dus exact op hetzelfde moment aan het einde van de tunnel.

De auteurs hebben een algoritme (een computerprogramma) gemaakt dat kijkt naar alle stukjes die in de scanner verschijnen. Als ze twee stukjes vinden die:

1. Op elkaar lijken (het ene is een stukje van het andere),
2. En precies op hetzelfde moment de scanner binnenkomen,

Dan weten ze: "Aha! Dit is geen echt nieuw stukje, dit is een afgebroken stukje van het andere!" Ze noemen dit retentie-tijd matching.

Wat hebben ze ontdekt?

Ze hebben duizenden datasets geanalyseerd en ontdekten verrassende dingen:

• Het is overal: In sommige experimenten is wel 30% van de gevonden stukjes eigenlijk maar afgebroken rommel. In experimenten met weinig variatie (zoals een simpele mix van eiwitten) is dit percentage zelfs nog hoger.
• De machine maakt het uit: Sommige massaspectrometers zijn 'beter' in het breken van eiwitten dan andere. Het instellen van de temperatuur of de spanning in de machine kan het aantal 'geestelijke' stukjes enorm verhogen of verlagen.
• Kleine stukjes zijn het slachtoffer: Vooral in de immunologie (waar men kijkt naar heel kleine stukjes eiwitten, vaak korter dan 9 letters) is het risico groot. Soms is meer dan een derde van de gevonden 'kleine stukjes' eigenlijk maar afval.

Wat betekent dit voor de toekomst?

De auteurs zeggen: "Stop met het negeren van dit probleem."

Ze stellen voor dat elke keer als iemand eiwitten scant, ze dit nieuwe programma moeten gebruiken om de 'geestelijke' stukjes te filteren.

• Voor de kwaliteit: Je krijgt dan een veel zuiverder beeld van wat er echt in je monster zit.
• Voor de kwantiteit: Het verandert niet zo veel hoeveel je van een eiwit hebt (de hoeveelheid blijft ongeveer gelijk), maar het voorkomt dat je denkt dat er meer soorten eiwitten zijn dan er echt zijn.

Kortom:
Massaspectrometrie is als een superkrachtige camera, maar soms maakt deze foto's van 'spookbeelden' (afgebroken stukjes). Deze paper leert ons hoe we die spookbeelden kunnen herkennen en verwijderen, zodat we eindelijk kunnen zien wat er echt in onze biologische soep zit. Voor onderzoekers die werken met kleine stukjes eiwitten (zoals in de immunologie) is dit een game-changer om fouten in hun diagnoses te voorkomen.

Technische samenvatting

Probleemstelling

In de proteomica, vooral bij peptide-gebaseerde analyses zoals immunopeptidomica, structurele proteomica en analyses van post-translatoire modificaties (PTM's), vormen in-source fragmentatie (ISF) producten een significant risico op data-misinterpretatie.

• Oorzaak: ISF treedt op tussen de chromatografische scheiding en de eerste massafilter van een tandem-massaspectrometer (MS), vaak veroorzaakt door de energie tijdens de ionisatie (bijv. electrospray ionization/ESI). Hierdoor ontstaan kunstmatige peptide-fragmenten die niet biologisch relevant zijn.
• Gevolg: Deze fragmenten worden vaak ten onrechte geïdentificeerd als echte biologische peptiden (bijv. semi-tryptische peptiden of peptiden zonder PTM's). Dit leidt tot een opgeblazen aantal identificaties en kan de interpretatie van kwantitatieve en kwalitatieve data verstoren, vooral in methoden die vertrouwen op niet-tryptische eindes of korte peptiden.
• Huidige situatie: Hoewel ISF in de metabolomica goed bestudeerd is, is het in de proteomica onderbelicht, mede omdat klassieke "bottom-up" proteomica zich richtte op tryptische peptiden en proteïne-aggregatie de effecten vaak camoufleerde. Met de opkomst van Data-Independent Acquisition (DIA) en steeds gevoeligere instrumenten, neemt de detectie van deze artefacten echter toe.

Methodologie

De auteurs ontwikkelden een bio-informatica-pijplijn om ISF te detecteren en kwantificeren, gebaseerd op retentietijd (RT) analyse.

1. Detectie-algoritme:

   • Het kernprincipe is dat een ISF-fragment en zijn ouderpeptide (parent) dezelfde aminozuursequentie delen (of een deel daarvan) en dezelfde retentietijd hebben, ondanks verschillen in massa en lading.
   • Het algoritme koppelt peptide-precursoren aan elkaar op basis van gedeelde sequenties.
   • Er wordt een verschil in retentietijd ($\Delta RT$) berekend tussen het kortere (fragment) en het langere (ouder) peptide.
   • Een dynamische $\Delta RT$-cutoff wordt bepaald per monster door de verdeling van $\Delta RT$ te analyseren voor peptideparen die alleen verschillen in lading (geen massa-verschil). Deze dienen als "ground truth" voor co-elutie.
   • Paren met een $\Delta RT$ onder deze cutoff worden geclassificeerd als ISF-gebaseerd.

2. Datasets en Validatie:

   • Er werden 13 nieuwe datasets gegenereerd met verschillende complexiteiten (van peptide-mixes tot volledige lysaten van S. cerevisiae, E. coli en menselijke cellen) en instrumenten (Orbitrap Exploris 480, Astral, Q Exactive Plus).
   • Deze werden geanalyseerd samen met 25 bestaande publicaties (totaal 317 monsters), waaronder immunopeptidomica, fosfoproteomica en beperkte proteolyse (LiP-MS).
   • Het algoritme werd gevalideerd tegen een commercieel algoritme (Spectronaut 20), waarbij een hoge overeenkomst (97,7%) werd gevonden.

3. Parameterstudies:

   • Invloed van instrumentparameters (funnel RF, ion transfer capillary temperatuur, spray voltage) op ISF werd systematisch getest.
   • Invloed op kwantificering werd getest via verdunningsreeksen van mengsels van gist en E. coli.

Belangrijkste Resultaten

• Prevalentie van ISF:

  • In standaard tryptische monsters is ongeveer 1% van de volledig tryptische peptiden en 22% van de semi-tryptische peptiden afkomstig van ISF.
  • De prevalentie varieert sterk: van <1% tot meer dan 33% van de totale peptide-identificaties in sommige datasets.
  • ISF is sterker vertegenwoordigd in laag-complexiteit monsters (bijv. peptide-mixes, affiniteitszuivering) dan in complexe proteoom-lysaten.
  • In immunopeptidomica-datasets kunnen ISF-fragmenten tot 37% uitmaken van alle geïdentificeerde peptiden korter dan 9 aminozuren.

• Karakteristieken:

  • ISF treedt voornamelijk op bij specifieke peptidebindingen (bijv. Val-Leu, Val-Ile, Val-Ala, en Proline aan de C-terminus).
  • De meeste ISF-fragmenten zijn semi-tryptisch (82% van de ISF-gebeurtenissen).
  • Er wordt ook ISF waargenomen bij PTM's (zoals methionine-oxidatie en fosforylering), waarbij de PTM-groep wordt afgesplitst, wat leidt tot een ongemodificeerd peptide dat als een echte identificatie kan worden gemist.

• Invloed van Instrumenten en Parameters:

  • ISF is sterk afhankelijk van het instrumenttype en de instellingen. Hogere funnel radiofrequenties (RF) en hogere ion transfer capillary temperaturen leiden tot een significante toename van ISF.
  • Het negeren van ISF kan leiden tot een verkeerde optimalisatie van methoden, omdat een hoge ISF-snelheid de totale hoeveelheid identificaties kunstmatig opblaast terwijl de echte peptide-identificaties dalen.

• Impact op Kwantificering:

  • Relatieve kwantificering: ISF heeft weinig negatief effect op de relatieve kwantificering van peptiden en proteïnen. Ouderpeptiden en ISF-fragmenten vertonen vaak zelfs betere kwantitatieve prestaties (lagere CV's) dan niet-ISF peptiden vanwege hun hogere intensiteit.
  • Kwalitatieve impact: Het grootste probleem is de kwalitatieve misinterpretatie. Het toevoegen van ISF-fragmenten aan ouderpeptide-groepen kan de relatieve kwantificering tussen monsters licht verstoren, maar het filteren van deze fragmenten is cruciaal om de juiste biologische conclusies te trekken.

• Specifieke Toepassingen:

  • Immunopeptidomica: ISF is hier een groot probleem omdat de zoekruimte al groot is en korte peptiden (<9 AA) vaak als artefacten worden geïnterpreteerd.
  • Beperkte Proteolyse (LiP-MS): Hoewel LiP-MS veel semi-tryptische peptiden produceert, bleek slechts een klein deel (0,6 - 2,0%) van de geïdentificeerde peptiden afkomstig te zijn van ISF. De meeste semi-tryptische signalen zijn dus echt biologisch.

Bijdragen en Significatie

1. Nieuwe Detectiemethode: De paper introduceert een robuuste, open-source methode om ISF te detecteren op basis van retentietijd-overeenkomst, wat essentieel is voor de nauwkeurigheid van moderne proteomica.
2. Kwantificering van het Probleem: Het werk toont aan dat ISF veel voorkomender is dan eerder gedacht, vooral in de context van DIA en peptide-gecentreerde analyses, en dat het een aanzienlijk deel van de data kan uitmaken.
3. Aanbevelingen voor de Gemeenschap:
   • ISF-detectie moet een standaard stap worden in de data-analyse van proteomica.
   • Voor peptide-gecentreerde toepassingen (zoals immunopeptidomica) wordt aanbevolen om ISF-fragmenten te re-annoteren en te filteren om misinterpretatie te voorkomen.
   • Alternatief kan het filteren van peptiden korter dan 9 aminozuren in immunopeptidomica helpen, hoewel de RT-methode superieur is omdat het ook langere fragmenten kan detecteren.
4. Toekomstperspectief: De auteurs wijzen erop dat verbeterde algoritmen nodig zijn om complexe ISF-netwerken en zijketen-fragmentaties op te lossen, wat kan leiden tot een beter begrip van de "ongekarteerde" ruimte in proteomische data.

Conclusie:
In-source fragmentatie is een groeiend probleem door de toenemende gevoeligheid van massaspectrometers. Hoewel het de relatieve kwantificering van proteïnen weinig beïnvloedt, vormt het een ernstig risico op kwalitatieve fouten, vooral bij het analyseren van korte of niet-tryptische peptiden. De voorgestelde RT-gebaseerde detectiemethode biedt een praktische oplossing om deze artefacten te identificeren en te elimineren, waardoor de betrouwbaarheid van proteomische studies wordt verhoogd.