DNA-Functionalized Nanoparticles for Multicolor Cathodoluminescence Imaging

Deze studie presenteert een DNA-gedreven oppervlakte-modificatiestrategie die lanthanide-nanopartikels hydrofiel maakt en stabiel houdt onder elektronenmicroscopie-omstandigheden, waardoor meerkleurige cathodoluminescentie-afbeelding van specifieke eiwitten naast celultrastructuur mogelijk wordt.

De kern

Stel je voor dat je een stad wilt verkennen. Je hebt twee soorten kaarten nodig:

1. De stratenkaart: Deze laat je zien hoe de gebouwen, bruggen en wegen eruitzien (de structuur).
2. De bewonerskaart: Deze laat je zien waar de specifieke mensen wonen en wat ze doen (de moleculen en eiwitten).

Het probleem is dat je deze twee kaarten normaal gesproken niet tegelijkertijd kunt maken. De "stratenkaart" (een elektronenmicroscoop) is super scherp, maar je ziet alleen de gebouwen. De "bewonerskaart" (een fluorescerende microscoop) laat je de mensen zien, maar de straten zijn dan wazig en onduidelijk.

De onderzoekers in dit artikel hebben een slimme oplossing bedacht om één perfecte kaart te maken die zowel de straten als de bewoners in haarscherp detail laat zien.

Hier is hoe ze dat deden, vertaald naar alledaagse taal:

1. De Probleemoplossers: De "Lantaarnpaaltjes"

De wetenschappers gebruiken kleine deeltjes, noem ze maar nanolantaarnpaaltjes (Lanthanide Nanoparticles).

• Hun kracht: Als je er met een elektronenstraal op schijnt (zoals een heel krachtige zaklamp), gaan ze niet alleen licht geven, maar kleurig licht. Elke kleur staat voor een ander type "bewoner" (eiwit).
• Het probleem: Deze lantaarnpaaltjes zijn in hun natuurlijke staat als een olieachtige druppel. Ze houden niet van water. Maar cellen in je lichaam bestaan uit water. Als je ze in een cel probeert te stoppen, blijven ze aan elkaar plakken (zoals olie in water) en werken ze niet.

2. De Magische Transformatie: Het DNA-Kostuum

Om deze olieachtige lantaarnpaaltjes waterbestendig te maken, hebben de onderzoekers ze een kostuum aangedaan.

• Ze hebben een heel kort stukje DNA (het bouwplan van het leven) aan de buitenkant van de lantaarnpaaltjes geplakt.
• De analogie: Stel je voor dat je een olieachtige steen in de oceaan wilt gooien. Je plakt er een sponsje (het DNA) omheen. Het sponsje houdt van water, waardoor de steen nu ook in het water kan drijven zonder aan elkaar te plakken.
• Dit DNA werkt ook als een haken en ogen-systeem. Later kunnen ze hier nog extra "haken" aan maken om de lantaarnpaaltjes precies op de juiste plek in de cel te laten plakken (bijvoorbeeld op een specifiek eiwit).

3. De Test: Overleven in de "Stoomkamer"

Voordat je een cel kunt bekijken onder een elektronenmicroscoop, moet je de cel eerst heel goed voorbereiden. Dit is een ruw proces:

• Je moet de cel "fixeren" (stevig maken).
• Je moet hem behandelen met zware chemicaliën (zoals osmiumtetroxide) om contrast te krijgen.
• Je moet hem drogen.

Normaal gesproken zouden de meeste lichtgevende deeltjes (zoals gewone verf of eiwitten) in dit proces hun licht verliezen, alsof je een kaars in een storm houdt. Maar de onderzoekers wilden weten: Blijven onze DNA-gedoopte lantaarnpaaltjes branden?

Het antwoord was een volmondig JA. Zelfs na de zware chemische behandelingen en het drogen, bleven de lantaarnpaaltjes helder oplichten. Ze waren net zo sterk als voorheen.

4. Het Grote Resultaat: De Kleurrijke Stad

In het laatste experiment lieten ze deze lantaarnpaaltjes op menselijke cellen (HEK293-cellen) landen.

• Ze gebruikten drie verschillende soorten lantaarnpaaltjes: één die rood licht gaf, één groen, en één blauw.
• Ze legden ze op de cel en keken erdoor de elektronenmicroscoop.

Wat zagen ze?
Ze zagen tegelijkertijd:

1. De structuur van de cel (de "straten" en het oppervlak) in zwart-wit, heel scherp.
2. De specifieke lantaarnpaaltjes die fel oplichtten in hun eigen kleuren, precies daar waar ze geplaatst waren.

Waarom is dit zo belangrijk?

Vroeger moest je eerst een foto maken met de ene microscoop, dan een andere foto met de andere, en die daarna met de hand samenvoegen (wat vaak mislukt omdat de beelden niet precies overeenkomen).

Met deze nieuwe methode krijg je één beeld waarin je direct ziet: "Ah, daar zit dat specifieke eiwit, en het zit precies op deze rand van het celmembraan."

Kort samengevat:
De onderzoekers hebben een manier gevonden om kleine, waterminnende, kleurrijke lichtjes te maken die bestand zijn tegen de ruwe behandeling van een elektronenmicroscoop. Hierdoor kunnen we nu voor het eerst de "straatplaat" van een cel en de "bewoners" die erop wonen, tegelijkertijd en perfect op elkaar afgestemd bekijken. Het is alsof we eindelijk een Google Maps hebben die zowel de wegen als de mensen in 4K-resolutie toont.

Technische samenvatting

Probleemstelling

De kernuitdaging in de biologische beeldvorming is het gelijktijdig visualiseren van specifieke eiwitten en de cellulaire ultrastructuur (zoals membranen, chromatine en het cytoskelet) op nanoschaal.

• Elektronenmicroscopie (EM) biedt uitstekende resolutie voor ultrastructuur, maar mist moleculaire specificiteit.
• Fluorescentiemicroscopie kan specifieke moleculen lokaliseren, maar kan de ongeëtiketteerde ultrastructuur niet intrinsiek oplossen en lijdt aan optische diffractielimieten.
• Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) probeert deze twee te combineren, maar wordt bemoeilijkt door incompatibele monsterbereidingsprotocollen, verschillen in ruimtelijke resolutie en de noodzaak van complexe post-acquisitie beeldregistratie.

Cathodoluminescentie (CL) microscopie biedt een potentieel alternatief door optische emissie direct te genereren via een elektronenbundel. Dit zou gelijktijdige beeldvorming van ultrastructuur (via secundaire elektronen) en moleculaire labels (via CL) mogelijk moeten maken met intrinsieke ruimtelijke registratie. Echter, de beschikbare lanthanide-nanopartikels (LNPs), die stabiel zijn onder de elektronenbundel en unieke emissiespectra hebben, hebben een hydrofobe oppervlakchemie (vaak omhuld met oleylzuur). Dit maakt ze ongeschikt voor biologische toepassingen in waterige omgevingen en vereist een oppervlaktefunctionalisatie die compatibel is met EM-monsterbereiding (zoals fixatie, kleuring en droging).

Methodologie

De auteurs ontwikkelden een strategie om hydrofobe LNPs om te zetten in wateroplosbare, biologisch compatibele probes via een DNA-liganduitwisseling:

1. Synthese van LNPs: Er werden monodisperse lanthanide-nanopartikels gesynthetiseerd via coprecipitatie in een mengsel van oleylzuur en octadecene. Er werden drie soorten LNPs gebruikt met verschillende lanthanide-dopanten voor multicolor imaging:

   • $NaHo_{0.8}Lu_{0.2}F_4$ (Holmium)
   • $NaDy_{0.8}Lu_{0.2}F_4$ (Dysprosium)
   • $NaTbF_4$ (Terbium)
   • Opmerking: Lutetium (Lu) werd gebruikt als co-dopant om deeltjesgrootte en vorm te controleren zonder de CL-brightness te beïnvloeden.

2. DNA-functionalisatie (LNPs@DNA):

   • De hydrofobe LNPs werden overgebracht van een organisch oplosmiddel (hexaan) naar een waterige fase.
   • Hiervoor werden korte enkelstrengs DNA-oligonucleotiden (specifiek 30-thymine, T30) gebruikt.
   • Het mechanisme berust op de sterke affiniteit tussen de fosfaatgroepen van het DNA en de positief geladen ionen op het oppervlak van de LNP.
   • Dit resulteerde in een één-staps proces waarbij de hydrofobe liganden werden vervangen door DNA, waardoor de deeltjes hydrofiel werden en verder konden worden gefunctionaliseerd.

3. Validatie van Stabiliteit en Emissie:

   • Dynamische Lichtverstrooiing (DLS): Gebruikt om de hydrodynamische diameter en stabiliteit in water te meten.
   • EM-monsterbereidingstests: De LNPs@DNA werden blootgesteld aan standaard EM-protocollen om te testen of de CL-emissie behouden bleef:
     • Kleuring met osmiumtetroxide ($OsO_4$) voor contrast.
     • Droging met hexamethyldisilazane (HMDS).
     • Kritisch punt drogen (CPD).
   • CL-imaging: Gebruik van een aangepaste Scanning Electron Microscope (SEM) met een parabolische spiegel en drie fotomultiplierbuizen (PMT's) voor gelijktijdige detectie in drie spectrale kanalen (Ho, Dy, Tb).

4. Biologische Toepassing:

   • LNPs@DNA werden toegevoegd aan het oppervlak van HEK293T-mammal cellen.
   • De cellen werden gefixeerd, met de deeltjes geïncubeerd, gedroogd en bedekt met een dunne Pt/Pd-laag om lading te voorkomen.

Belangrijkste Bijdragen

• Ontwikkeling van een DNA-gemedieerde liganduitwisseling: Een robuuste methode om hydrofobe LNPs wateroplosbaar te maken zonder complexe coatingprocessen (zoals silica-coating of polymeeromhulling), wat aggregatie minimaliseert.
• Validatie van CL-stabiliteit onder EM-omstandigheden: Het aantonen dat LNPs hun luminescentie behouden na agressieve chemische behandelingen ($OsO_4$) en fysieke drogingsprocessen die doorgaans organische kleurstoffen vernietigen.
• Multicolor Imaging in Biologische Context: De eerste demonstratie van gelijktijdige, spectrale onderscheiding van meerdere nanopartikels op het oppervlak van levende cellen, gekoppeld aan hoge-resolutie ultrastructuurbeelden.

Resultaten

• Hydrofiele Overdracht: Na functionalisatie met T30-DNA gingen de LNPs over in de waterfase. DLS-metingen toonden een toename van de hydrodynamische diameter van ~13 nm (as-synthetisch) naar ~55 nm, wat wijst op een DNA-laag en/of kleine aggregaten, maar bevestigt dat ze in oplossing blijven.
• Behoud van CL-brightness:
  • De LNPs@DNA in water vertoonden vergelijkbare helderheid als de oorspronkelijke hydrofobe deeltjes in hexaan.
  • Na blootstelling aan $OsO_4$ daalde de helderheid lichtjes (door oxidatie van het oppervlak), maar de deeltjes bleven detecteerbaar.
  • Na HMDS- en CPD-droging bleef de CL-signaalsterkte behouden, zelfs met een lichte toename in sommige gevallen.
• Multicolor Imaging:
  • De auteurs konden individuele LNPs onderscheiden op basis van hun emissie in specifieke spectrale vensters: Ho3+ (647 nm), Dy3+ (572 nm) en Tb3+ (545 nm).
  • Op HEK293-cellen konden twee- en drie-kleurige CL-afbeeldingen worden gegenereerd die perfect gecorreleerd waren met de secundaire elektronen (SE) beelden van de celmembranen.
  • Dit maakte het mogelijk om verschillende deeltjes op het celoppervlak te identificeren zonder complexe beeldregistratie-algoritmen.

Significantie

Dit werk is een belangrijke doorbraak voor de ontwikkeling van cathodoluminescentie als een nieuwe modus voor biologische beeldvorming.

1. Oplossing voor CLEM-beperkingen: Het elimineert de noodzaak voor complexe correlatieve workflows en beeldregistratie, omdat ultrastructuur en moleculaire labels gelijktijdig en intrinsiek geregistreerd worden.
2. Robuuste Probes: Het toont aan dat anorganische LNPs, in tegenstelling tot organische fluoroforen, bestand zijn tegen de zware chemische en fysieke omstandigheden van EM-monsterbereiding.
3. Toekomstperspectief: De DNA-functionalisatie biedt een platform voor verdere targeting. Door complementaire DNA-sequenties, aptameren, antilichamen of nanobodies aan het DNA te koppelen, kunnen specifieke eiwitten of nucleïnezuren op nanoschaal worden gelokaliseerd binnen hun cellulaire context. Dit opent de deur tot het bestuderen van complexe biologische processen (zoals endocytose, synaptische communicatie en celcyclus) met ongekende ruimtelijke precisie.