Phenotypic screening for small molecules that lower PrP in cultured cells

Hoewel een fenotypische screening in muiscelculturen twee verbindingen identificeerde die PrP selectief verlaagden via een post-translationeel mechanisme, faalden deze middelen in menselijke cellijnen en in vivo, wat de beperkingen van mechanisme-agnostische screening voor prionziekte-therapieën benadrukt.

De kern

De Missie: Een "Slechte Kloon" Jagen

Stel je voor dat in je hersenen een heel specifiek eiwit, genaamd PrP, zich begint te vermenigvuldigen op een rare manier. In plaats van normaal te werken, verandert het in een "kwaadaardige kloon" die andere gezonde eiwitten aanvalt. Dit zorgt voor een ziekte die we prionziekte noemen (zoals de gekke koeienziekte, maar dan bij mensen).

De wetenschappers in dit artikel dachten: "Als we simpelweg de hoeveelheid van dit normale PrP-eiwit in de hersenen kunnen verlagen, stopt de ziekte vanzelf." Het is alsof je de voorraadkast leeghaalt waar de kwaadaardige klonen hun bouwstenen vandaan halen.

De Grote Zoektocht: Een Naald in een Hooiberg

Om dit te doen, wilden ze een pilletje (een klein molecuul) vinden dat deze PrP-voorraad kan verlagen. Ze hadden een enorme hooiberg met 3.492 verschillende pillen (een bibliotheek van chemicaliën).

Ze deden een slimme test in een laboratorium:

1. Ze gebruikten muiscellen die een groen lampje (GFP) hadden.
2. Ze hadden ook een rood lampje (PrP) dat ze wilden doven.
3. De regel: Als een pil het rode lampje dooft, maar het groene lampje laat branden en de cel niet doodt, is het een winnaar. Als de pil het groene lampje ook dooft of de cel doodt, is het een slechte pil (te giftig).

De Verrassing: Twee Kandidaten

Na het testen van duizenden pillen vonden ze er twee die het rood lampje heel goed doofden zonder de cel te doden:

• EYH
• LCZ

Het leek alsof ze de "heilige graal" hadden gevonden. Ze waren zelfs zo specifiek dat ze bijna alleen maar PrP aanvielen, net als een slimme raket die alleen op het doelwit schiet en niet op de omgeving.

De "Maakbaarheid" van de Pil: Hoe werkt het?

De wetenschappers keken diep in de cel om te zien hoe deze pillen werkten.

• Het geheim: Ze ontdekten dat de pillen het PrP-eiwit niet blokkeerden voordat het gemaakt werd, maar het juist vernietigden nadat het gemaakt was. Het is alsof je niet de fabriek sluit, maar de afvalverwerker aanzet die het product direct na de productie weghaalt.
• De valkuil: Ze wisten niet precies welke knop ze op de machine drukten. Het was alsof ze een auto zagen rijden en wisten dat hij brandstof verbruikte, maar ze wisten niet welke motoronderdelen precies werden aangeraakt.

De Teleurstelling: Van Muizen naar Mensen

Hier wordt het verhaal een beetje pijnlijk. Wat in de muiscellen (N2a) perfect werkte, faalde in de menselijke cellen.

• De Muizen-Test: In muiscellen werkte het wonderlijk goed.
• De Mensen-Test: Toen ze de pillen in menselijke cellen (zoals hersencellen) probeerden, deden ze bijna niets. Om een effect te hebben, moesten ze de dosis zo hoog maken dat de cellen doodgingen. Het was alsof je een sleutel hebt die perfect in een muisslot past, maar in een mensenslot helemaal niet werkt.

De Eindtest: De Proef op de Som

Uiteindelijk gaven ze de pillen aan echte muizen (via een buisje in de maag) gedurende 14 dagen.

• Het resultaat: Niets. De hoeveelheid PrP in de hersenen van de muizen bleef precies hetzelfde. De pillen bereikten de hersenen, maar deden daar niets.

Wat betekent dit voor de toekomst?

Dit artikel is eigenlijk een heel eerlijk verhaal over hoe moeilijk het is om medicijnen te vinden.

1. De les: Het vinden van een pil die werkt in een simpele test (muiscellen) betekent niet dat het werkt in een echt mens.
2. De conclusie: De auteurs zeggen: "We hebben geprobeerd om een magische pil te vinden zonder te weten hoe hij werkt (een 'blind' zoeken), maar dat was erg moeilijk."
3. De toekomst: Ze concluderen dat we misschien beter kunnen stoppen met het blind zoeken naar willekeurige pillen. In plaats daarvan moeten we focussen op slimmere, gerichte methoden (zoals genetische therapieën of andere technologieën die we al begrijpen), omdat die een veel grotere kans van slagen hebben.

Kort samengevat: Het was een spannende zoektocht naar een medicijn dat een slecht eiwit weghaalt. Ze vonden twee kandidaten die in de testbuis leken te werken, maar bleken in de echte wereld (mens en dier) niet te functioneren. Het is een bewijs dat de weg naar een geneesmiddel voor prionziekten nog heel steil is, en dat we misschien andere, meer gerichte routes moeten kiezen.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Prionziekten zijn snel progressieve neurodegeneratieve aandoeningen die worden veroorzaakt door de accumulatie van misgevouwen conformers van het endogene PrP-eiwit (prionproteïne). De hoeveelheid PrP is direct gerelateerd aan de snelheid van ziekteprogressie; het verlagen van PrP-niveaus is een gevalideerde therapeutische strategie. Hoewel platform-technieken zoals antisense-oligonucleotiden (ASO's) en siRNA succesvol zijn gebleken, vereisen deze vaak intrathecale toediening of complexe virale vectoren. Kleine moleculen bieden een aantrekkelijk alternatief vanwege hun vermogen om weefsels te diffunderen zonder beperkte distributie. Eerdere pogingen om kleine moleculen te vinden die PrP verlagen via fenotypische screens hebben echter gefaald in het vinden van middelen met in vivo werkzaamheid. De uitdagingen omvatten het identificeren van niet-specifieke cytotoxische verbindingen, PAINS (pan-assay interference compounds), en het gebrek aan reproduceerbaarheid tussen cel lijnen.

Methodologie

De auteurs ontwierpen een geavanceerd fenotypisch screeningprogramma met de volgende kerncomponenten:

1. Celmodel en Counter-screen: Ze gebruikten muizen N2a-cellen die stabiel GFP (cytosolisch) of GFP-GPI (geankerd aan het membraan, analoog aan PrP) tot expressie brengen. Dit stelde hen in staat om verbindingen te selecteren die PrP verlaagden zonder de algemene cellevensvatbaarheid of de expressie van een referentie-eiwit (GFP) te beïnvloeden.
2. Bibliotheek: Er werd gescreend op een gecurateerde bibliotheek van 3.492 verbindingen met bekende werkingsmechanismen (de "MoA box"), om het risico op PAINS te minimaliseren.
3. High-Content Imaging: De primaire screening vond plaats in 1536-well platen met technische duplicaten. De selectiecriteria waren een vermindering van PrP-signalen zonder verlies van GFP-signalen of celgetallen.
4. Validatie en Karakterisering:
   • Dosis-respons: Hits werden getest in 4- en 8-punts dosis-responscurves.
   • Proteomics: Tandem Mass Tag (TMT) proteomics werd uitgevoerd op gehele cel-lysaten om de specificiteit te bepalen (welke andere eiwitten worden beïnvloed?).
   • Mechanisme-onderzoek: RT-qPCR voor mRNA-niveaus, transfectie-experimenten in niet-PrP-expresserende RK13-cellen, en co-behandeling met proteasoom- (MG132) en lysosoom- (Bafilomycin A1) inhibitoren om het degradatieweg te identificeren.
   • Human cellen: Testen in een panel van menselijke cel lijnen (U251-MG, HEK293, A375, etc.) om de relevantie voor de mens te beoordelen.
   • In vivo: Muizen werden 14 dagen lang oraal behandeld met 100 mg/kg van de leidende verbindingen, gevolgd door analyse van PrP-niveaus in hersenen en colon, evenals farmacokinetische metingen.

Belangrijkste Bijdragen en Resultaten

1. Identificatie van Kandidaten: Uit de screening kwamen drie verbindingen naar voren: EYH, LCZ en Y-320. EYH en LCZ toonden een hoge specificiteit voor PrP-verlaging, terwijl Y-320 een breed effect had op het proteoom.
2. Proteomische Specificiteit:
   • EYH verlaagde PrP als het meest gedownreguleerde eiwit (van 8.722 gemeten eiwitten) en beïnvloedde slechts 0,2% van het proteoom significant.
   • LCZ verlaagde PrP als het tweede meest gedownreguleerde eiwit en beïnvloedde 0,6% van het proteoom.
   • Y-320 had een breed effect (24% van het proteoom) en werd daarom verworpen als te promiscue.
3. Post-translationeel Mechanisme:
   • De verbindingen hadden een minimaal effect op Prnp-mRNA, wat wijst op een post-translationeel mechanisme.
   • Ze waren actief in niet-deelende primaire neuronen, wat suggereert dat ze bestaand PrP opruimen in plaats van de synthese te blokkeren.
   • Co-behandeling met de proteasoom-inhibitor MG132 leidde tot accumulatie van onglycosyleerd PrP, wat aantoont dat de ubiquitine-proteasoomweg verantwoordelijk is voor de PrP-afbraak. Lysosomale degradatie werd uitgesloten.
4. Gebrek aan Werkzaamheid in Menselijke Cellen:
   • In menselijke cel lijnen (zoals U251-MG) waren EYH en LCZ veel minder potent (EC50 > 20 µM) dan in N2a-cellen.
   • Bij de concentraties die nodig waren om PrP te verlagen in menselijke cellen, trad er significante cytotoxiciteit op, wat resulteerde in een onaanvaardbaar therapeutisch venster.
5. Geen In Vivo Activiteit:
   • Ondanks dat de farmacokinetische metingen aantoonden dat de concentraties in het brein en de colon van muizen boven de in vitro EC50-waarden lagen, werd er geen vermindering van PrP waargenomen in het brein of de colon na 14 dagen behandeling.

Significantie en Conclusie

De studie benadrukt de fundamentele uitdagingen van mechanisme-agnostische fenotypische screens voor PrP-verlaging:

• Modelvaliditeit: Het succes in muizen N2a-cellen vertaalde zich niet naar menselijke cellen of in vivo modellen. Dit wijst op een ernstig probleem met de voorspellende waarde van muizen N2a-cellen voor menselijke PrP-regulatie door kleine moleculen.
• Polyfarmacologie: Zelfs bij het gebruik van een gecurateerde bibliotheek met bekende mechanismen, lijken de gevonden hits (EYH en LCZ) te werken via onbekende mechanismen die pas bij hoge concentraties zichtbaar worden, wat leidt tot een gebrek aan specificiteit in menselijke systemen.
• Strategische Implicatie: De auteurs concluderen dat de investering in mechanisme-agnostische kleine moleculen voor prionziekten waarschijnlijk niet de meest effectieve route is. In plaats daarvan ondersteunen ze een verschuiving naar rationele, op platform-technologieën gebaseerde benaderingen (zoals ASO's, siRNA, en virale vectoren) met bekende werkingsmechanismen en bewezen in vivo werkzaamheid, aangezien deze meer voorspelbaar zijn voor de menselijke geneeskunde.

Kortom, hoewel de studie technisch succesvol was in het identificeren van selectieve PrP-verlagers in een muismodel, faalde het in het vinden van therapeutisch bruikbare kandidaten, wat de complexiteit van het ontwikkelen van kleine moleculen voor neurodegeneratieve ziekten onderstreept.