Divergent consequences of PSEN1 knockout and PSEN2 knockout in stem cell derived models of the brain

Dit onderzoek toont aan dat PSEN1- en PSEN2-knockout in stamcel-afgeleide hersencellen verschillende, niet-redundante effecten hebben, waarbij PSEN2-verlies specifiek het endo-lysosomale systeem beïnvloedt zonder de APP-verwerking of Aβ-productie te verstoren, wat cruciale inzichten biedt voor de ontwikkeling van therapies voor de ziekte van Alzheimer.

De kern

De Twee Broers in de Cel: Waarom PSEN1 en PSEN2 niet hetzelfde doen

Stel je voor dat je hersencellen een enorme, drukke fabriek zijn. In deze fabriek werken er duizenden machines om de cellen gezond te houden. Een van de belangrijkste machines is de "γ-secretase". Je kunt deze machine zien als een slimme schaar die door de celwand snijdt om oude of beschadigde onderdelen te verwijderen en nieuwe te maken.

Deze schaar heeft twee verschillende meestersnijders die ze kunnen gebruiken: PSEN1 en PSEN2.

• PSEN1 is de ervaren, snelle meester die het meeste werk doet.
• PSEN2 is de andere meester, die wat meer gespecialiseerd is in een andere hoek van de fabriek.

In het verleden dachten wetenschappers dat deze twee meesters bijna identiek waren en elkaar makkelijk konden vervangen. Maar dit nieuwe onderzoek, gedaan met stamcellen van mensen, laat zien dat ze heel verschillend zijn. Als je de één weghaalt, gebeurt er iets heel anders dan als je de ander weghaalt.

Het Experiment: De "Uit" knop indrukken

De onderzoekers gebruikten een soort genetische schaar (CRISPR) om in de DNA-architectuur van stamcellen de instructies voor PSEN1 of PSEN2 volledig te wissen. Vervolgens lieten ze deze cellen uitgroeien tot hersencellen (neuronen) en immuuncellen (microglia), en keken ze wat er gebeurde.

Wat vonden ze?

1. PSEN1 is de "Alles-in-Eén" Schaar
Toen ze PSEN1 uitschakelden, ging de fabriek in paniek:

• De Schaar stopte: De belangrijkste taak van de schaar (het knippen van een eiwit genaamd APP) kwam vast te zitten. Hierdoor hoopten er afvalstoffen op en werd er minder van het bekende "Alzheimer-plaagje" (amyloïd) gemaakt.
• De Machine viel uit: De schaar zelf (de γ-secretase) kon niet meer goed worden samengesteld. Het was alsof je de motor uit een auto haalt; de auto rijdt niet meer.
• Conclusie: Zonder PSEN1 stopt de hoofdproductie van de fabriek. Dit verklaart waarom mutaties in PSEN1 vaak leiden tot een vroeg begin van de ziekte van Alzheimer.

2. PSEN2 is de "Vuilnisman" van de Kelder
Toen ze PSEN2 uitschakelden, gebeurde er iets heel anders:

• De Schaar werkt nog: De belangrijkste taak (APP knippen) ging gewoon door. De fabriek produceerde nog steeds normaal afval en nieuwe onderdelen. De andere meester (PSEN1) nam het werk van PSEN2 over zonder problemen.
• Maar de Kelder raakte vol: PSEN2 bleek vooral belangrijk te zijn voor het schoonmaken van de kelder (het endo-lysosoomsysteem). Zonder PSEN2 hoopten er oude dozen (eiwitten) op in de kelder en raakte het vuilnisstelsel verstopt.
• Conclusie: Zonder PSEN2 werkt de hoofdproductie nog, maar de afvalverwerking in de cel raakt in de war.

Een creatieve metafoor: De Huisbaas en de Huishoudster

Stel je een huis voor:

• PSEN1 is de Huisbaas. Hij doet de belangrijke klusjes: hij repareert het dak, zorgt voor de verwarming en houdt de deur open. Als de Huisbaas weggaat, stort het hele huis in elkaar (de cellen sterven of functioneren slecht).
• PSEN2 is de Huishoudster die zich specifiek richt op de kelder en de afvalbakken. Als de Huishoudster weggaat, blijft het dak nog wel goed (de hoofdtaak gaat door), maar de kelder raakt vol met oud spul en begint te stinken.

Waarom is dit belangrijk?

Vroeger dachten artsen dat je de "γ-secretase schaar" volledig kon uitschakelen om Alzheimer te behandelen. Maar omdat PSEN1 zo belangrijk is voor het overleven van de cel, leidde dit tot ernstige bijwerkingen (zoals huidziektes) en faalde de behandeling.

Dit onderzoek geeft een nieuwe hoop:

• Misschien hoeven we niet de hele schaar te stoppen.
• Misschien kunnen we specifiek de "Huisbaas" (PSEN1) moduleren of juist de "Huishoudster" (PSEN2) helpen, zonder de hele fabriek plat te leggen.
• Het laat zien dat we heel precies moeten zijn in onze medicijnen. Als je een medicijn maakt dat alleen PSEN2 beïnvloedt, krijg je misschien niet de bijwerkingen die je krijgt als je PSEN1 raakt.

Samenvatting

Deze studie toont aan dat PSEN1 en PSEN2 niet uitwisselbaar zijn.

• PSEN1 is cruciaal voor het snijden van eiwitten en het overleven van de cel.
• PSEN2 is cruciaal voor het schoonmaken van de cel (afvalverwerking).

Door dit verschil te begrijpen, kunnen wetenschappers in de toekomst betere, veiligere medicijnen ontwikkelen die precies op het juiste doelwit mikken, zonder de rest van de hersencellen te beschadigen.

Technische samenvatting

Probleemstelling

De $\gamma$-secretase-complexen zijn multi-subunit enzymen die verantwoordelijk zijn voor de proteolyse van honderden substraten. Deze complexen bestaan uit obligate subunits (PEN-2 en Nicastrin) en alternatieve katalytische subunits: Presenilin 1 (PSEN1) of Presenilin 2 (PSEN2).

• Klinische relevantie: Mutaties in PSEN1 en PSEN2 veroorzaken familiaire Alzheimer's ziekte (fAD). Daarentegen leiden verlies-van-functie mutaties in PSEN1, PSENEN (PEN-2) en NCSTN (Nicastrin) tot huidziekten zoals acne inversa.
• De uitdaging: Eerdere klinische trials met $\gamma$-secretase-remmers faalden vanwege ernstige bijwerkingen, waarschijnlijk veroorzaakt door een gebrek aan specificiteit en een onvolledig begrip van de functionele diversiteit tussen de verschillende $\gamma$-secretase-complexen.
• De kennislacune: Hoewel diermodellen suggereren dat PSEN1 en PSEN2 verschillende rollen spelen (PSEN1-knockout muizen zijn embryonaal letaal, terwijl PSEN2-knockout muizen levensvatbaar zijn), ontbreekt er een gedetailleerd inzicht in de specifieke, niet-redundante functies van deze subunits in menselijke hersencellen.

Methodologie

De onderzoekers gebruikten geavanceerde in vitro modellen gebaseerd op geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) om de gevolgen van het uitschakelen van PSEN1 versus PSEN2 te vergelijken.

1. Genoomeditie (CRISPR-Cas9):
   • Er werden isogene iPSC-lijnen gegenereerd waarbij PSEN2 werd geknipt (knockout) via CRISPR-Cas9 in exon 5.
   • Deze nieuwe lijnen werden vergeleken met eerder gegenereerde PSEN1-knockout iPSC's en een onbewerkte controlelijn.
   • De efficiëntie van de editing werd geverifieerd via Sanger sequencing en software (TIDE/ICE), en off-target effecten werden uitgesloten.
2. Differentiatie:
   • De iPSC's werden gedifferentieerd naar twee celtypen:
     • Corticale glutamaat-gebruikende neuronen (tot dag 100).
     • Microglia-achtige cellen (iMGLCs).
3. Analysemethoden:
   • Western Blotting: Om de expressie van eiwitten te meten, waaronder PSEN1/2, Nicastrin (rijping), APP (cleavage), TREM2, en endosoom/lysosoom markers (EEA1, RAB5, LAMP1).
   • qPCR: Om mRNA-niveaus te bepalen en te controleren op transcriptie-veranderingen.
   • ELISA (Meso Scale Discovery): Om de concentraties van amyloid-beta peptiden (Aβ38, Aβ40, Aβ42) in het conditioned medium te kwantificeren.
   • Statistiek: One-way ANOVA met meervoudige vergelijkingen op basis van minimaal 3 onafhankelijke differentiaties.

Belangrijkste Bijdragen

• Vergelijkend model: Dit is een van de eerste studies die direct de fenotypische gevolgen van PSEN1- versus PSEN2-knockout vergelijkt in menselijke, geïnduceerde neuronen en microglia, gebruikmakend van isogene lijnen om genetische variatie uit te sluiten.
• Functionele divergentie: Het werk biedt bewijs dat PSEN1 en PSEN2 niet volledig redundant zijn, maar specifieke, celtype- en subceltype-specifieke rollen hebben.
• Mechanistisch inzicht: Het onthult dat het verlies van PSEN2 voornamelijk het endo-lysosomale systeem beïnvloedt, terwijl het verlies van PSEN1 de proteolyse van specifieke substraten (zoals APP en TREM2) verstoort.

Resultaten

1. Effecten in iPSC-Neuronen:

• APP-verwerking en Aβ-productie:
  • PSEN1-knockout: Leidde tot een accumulatie van APP C-terminale fragmenten (CTF's), een defecte rijping van Nicastrin (glycosylering) en een reductie van ~60% in de productie van alle Aβ-soorten.
  • PSEN2-knockout: Geen significante veranderingen in APP-verwerking, geen accumulatie van CTF's, en geen verandering in de concentratie of verhouding van Aβ-peptiden (Aβ38/40/42) vergeleken met controles.
• Nicastrin-rijping: De rijping van Nicastrin bleef intact in PSEN2-knockout neuronen, in tegenstelling tot de defecte rijping bij PSEN1-knockout.
• Compensatie: Er werd een significante compensatoire opregulatie van PSEN2-eiwit waargenomen in PSEN1-knockout neuronen, maar niet andersom (PSEN1 nam niet toe bij PSEN2-verlies).

2. Effecten in iPSC-Microglia (iMGLCs):

• TREM2-verwerking: TREM2 is een belangrijke $\gamma$-secretase-substraat in microglia.
  • PSEN1-knockout: veroorzaakte een significante accumulatie van TREM2 C-terminale fragmenten, wat wijst op een defect in de cleavage.
  • PSEN2-knockout: Geen verandering in TREM2-verwerking of -rijping; de processie leek identiek aan die van de controlecellen.

3. Endo-lysosomale Systemen (Specifiek voor PSEN2):

• PSEN2-knockout neuronen vertoonden een accumulatie van vroege endosoom-markers (EEA1 en RAB5) en een reductie van lysosomale markers (LAMP1).
• Deze fenotypes werden niet waargenomen in PSEN1-knockout neuronen.
• qPCR-analyses toonden aan dat de mRNA-niveaus van deze markers niet veranderd waren, wat suggereert dat het defect post-transcriptioneel is (bijv. in het transport of de stabiliteit van de eiwitten).

Significantie en Conclusie

De studie bevestigt dat PSEN1 en PSEN2 fundamenteel verschillende rollen spelen in menselijke hersencellen:

• PSEN1 is de dominante katalytische subunit voor de verwerking van membraaneiwitten zoals APP en TREM2 aan het plasmamembraan. Dit verklaart waarom PSEN1-mutaties de vroegste en ernstigste vormen van fAD veroorzaken.
• PSEN2 heeft een meer gespecialiseerde rol in het endo-lysosomale systeem. Het verlies van PSEN2 leidt tot verstoringen in het endocytische transport en lysosomale functie, zonder de directe productie van Aβ te beïnvloeden in deze context.

Therapeutische Implicaties:
Deze bevindingen ondersteunen de noodzaak van subtypespecifieke targeting van $\gamma$-secretase. In plaats van het hele complex te remmen (wat leidt tot bijwerkingen door het blokkeren van essentiële substraten zoals Notch), zou het mogelijk kunnen zijn om therapeutisch in te grijpen op specifieke PSEN1- of PSEN2-afhankelijke complexen. Dit zou de precisie van behandelingen voor Alzheimer's ziekte kunnen verhogen en de toxiciteit verminderen. De studie benadrukt ook dat het onderscheid tussen "loss-of-function" (zoals in deze knockout-modellen) en pathogene mutaties (zoals bij fAD) cruciaal is, aangezien mutaties vaak andere, soms toxische, effecten hebben dan een volledige afwezigheid van het eiwit.