Long-Stokes-Shift mScarlet3 as a Structural Marker for Two-Photon Imaging

Deze studie introduceert een transgene Drosophila-lijn met het lang-Stokes-verschuivende eiwit LSSmScarlet3, waarmee anatomische structuren en functionele calciumdynamica gelijktijdig met één 920-nm-laser kunnen worden afgebeeld, wat de complexiteit en kosten van twee-fotonenmicroscopie verlaagt.

De kern

Stel je voor: Een tweeling in een donkere kamer

Stel je voor dat je een heel klein, levend universum bekijkt: de hersenen van een fruitvliegje. Wetenschappers willen twee dingen tegelijk zien:

1. Wat de cellen doen: Bijvoorbeeld wanneer een zenuwcel 'aan' gaat (een flits van activiteit).
2. Waar de cellen zitten: De vaste structuur, zodat je weet welke cel welke is en of het vliegje beweegt.

Het oude probleem: Twee verschillende sleutels
Vroeger was dit als een raadsel. Om de activiteit te zien, gebruikten ze een groene lichtbron (een speciale laser). Om de structuur te zien, hadden ze een rode lichtbron nodig.
Het probleem? Je had twee verschillende sleutels nodig om twee verschillende deuren open te maken. In de praktijk betekende dit dat je een heel duur, complex apparaat nodig had met twee lasers. Het was alsof je twee verschillende gereedschappen nodig had om één taak te doen. Bovendien kon het te veel licht zijn voor de delicate cellen (fototoxiciteit), alsof je ze verblindde met te fel licht.

De nieuwe oplossing: De 'Chameleonsleutel'
In dit artikel beschrijven de onderzoekers een slimme nieuwe manier om dit op te lossen. Ze hebben een nieuw type fluorescerend eiwit ontwikkeld, genaamd LSSmScarlet3.

Stel je dit eiwit voor als een chameleonsleutel.

• Normale rode sleutels werken alleen met rood licht.
• Deze nieuwe 'chameleonsleutel' is speciaal ontworpen. Hij kan worden 'opgestart' met groen licht (of in dit geval, een laser die op 920 nanometer werkt, wat dicht bij het groene spectrum ligt), maar hij geeft rood licht terug.

Dit fenomeen heet een "grote Stokes-verschuiving" (Long-Stokes-Shift). In gewone taal: je geeft het een lichtje in de ene kleur, en het geeft een heel andere kleur terug.

Hoe werkt het in de praktijk?
De onderzoekers hebben fruitvliegjes gemaakt die dit eiwit van nature in hun hersenen dragen.

1. Ze zetten één enkele laser aan (deze werkt op 920 nm).
2. Deze laser doet twee dingen tegelijk:
   • Hij laat de groene sensor (die de activiteit meet) oplichten.
   • Hij laat de nieuwe rode 'chameleonsleutel' (LSSmScarlet3) oplichten, ook al is het licht dat hij krijgt niet rood.
3. Omdat de rode kleur die terugkomt heel anders is dan het groene licht, kunnen de camera's ze perfect uit elkaar houden. Het is alsof je twee verschillende radiozenders hoort die op hetzelfde moment spelen, maar op totaal verschillende frequenties. Je kunt ze beide duidelijk horen zonder dat ze door elkaar heen klinken.

Waarom is dit geweldig?

• Eén laser, twee kleuren: Je hebt geen dure tweede laser meer nodig. Het apparaat wordt simpeler en goedkoper.
• Minder schade: Omdat je niet twee keer hoeft te scannen met verschillende lasers, krijgen de cellen minder lichtstres.
• Perfecte timing: Omdat alles tegelijk gebeurt, zie je precies wat er gebeurt op het moment dat het gebeurt, zonder vertraging.

De conclusie
De onderzoekers hebben bewezen dat je met deze nieuwe 'chameleonsleutel' (LSSmScarlet3) in één keer zowel de activiteit als de bouwtekening van de hersenen van een fruitvlieg kunt zien, met slechts één laser. Het is een stukje techniek dat de weg vrijmaakt voor heldere, snelle en minder ingrijpende inzichten in hoe onze hersenen (en die van fruitvliegjes) werken.

Technische samenvatting

Technische Samenvatting: Lang-Stokes-verschuivende mScarlet3 als Structurele Marker voor Twee-Photon Imaging

1. Het Probleem
In de neurobiologie is het essentieel om zowel neurale activiteit (functionele imaging) als anatomische relaties (structurele imaging) tegelijkertijd te monitoren. Gebruikers maken vaak gebruik van genetisch gecodeerde calciumindicatoren op basis van groene fluorescente eiwitten (zoals de GCaMP-serie, die blauw wordt aangeslagen). Om cellen te identificeren en beweging te corrigeren, worden vaak rode fluorescente eiwitten (RFP's, zoals tdTomato of mCherry) als structurele markers mee-expressie.

Het huidige nadeel is dat deze RFP's doorgaans een aparte excitatiegolflengte vereisen (bijvoorbeeld ~1040 nm) dan de groene sensoren (meestal 920 nm). Dit vereist complexe multi-laser-opstellingen, wat leidt tot:

• Hogere kosten en complexiteit van de apparatuur.
• Verhoogde fototoxiciteit door langere blootstellingstijden of sequentiële scans.
• Moeilijkere temporale registratie tussen de kanalen.

2. Methodologie
De auteurs hebben een transgene Drosophila melanogaster (fruitvlieg) lijn ontwikkeld die een codon-geoptimaliseerde versie van LSSmScarlet3 (Long-Stokes-shift mScarlet3) tot expressie brengt. LSSmScarlet3 is een variant met een grote Stokes-verschuiving (excitatie en emissie zijn ver uit elkaar), wat in theorie het mogelijk maakt om het eiwit aan te sluiten met dezelfde laser die wordt gebruikt voor groene sensoren.

De studie omvatte de volgende stappen:

• Constructie: Het coderende sequentie van LSSmScarlet3 werd geoptimaliseerd voor Drosophila en gekloond in een UAS-vector voor expressie onder controle van Gal4 (specifiek MB247-Gal4 voor de mushroom body in de hersenen).
• Spectrale Karakterisatie: De excitatie- en emissiespectra werden gemeten in gefixeerd Drosophila-weefsel en in HEK293T-cellen die LSSmScarlet3 tot expressie brachten.
• Imaging Setup: Er werd gebruik gemaakt van een standaard twee-photon (2P) microscoop uitgerust met één enkele laser (afgestemd op 920 nm) en twee fotomultiplierbuizen (PMT's): één voor het groene kanaal en één voor het rode kanaal.
• Experimenten:
  • In vitro: Expressie in HEK293T-cellen om cross-talk tussen kanalen te testen bij variërende laservermogens.
  • In vivo: Co-expressie van LSSmScarlet3 en GCaMP8m in de mushroom body van levende vliegen om simultane imaging te demonstreren.

3. Belangrijkste Resultaten

• Excitatie-eigenschappen: LSSmScarlet3 toonde een piekexcitatie bij 940 nm, maar had ook lokale maxima bij 860 nm en 1040 nm. Belangrijker nog: bij de veelgebruikte 920 nm-laser (standaard voor GCaMP) werd ongeveer 75% van de piekintensiteit bereikt (99 eenheden versus 132 eenheden bij 940 nm).
• Emissie en Cross-talk: De emissiepiek lag rond de 620 nm. Bij gebruik van een 920 nm-laser werd er een sterke signaal detectie waargenomen in het rode PMT-kanaal, terwijl het groene kanaal geen signaal detecteerde tot het laservermogen boven de 50% steeg. Pas bij ongeveer 60% vermogen werd er merkbare cross-talk waargenomen. Dit bevestigt dat de kanalen goed gescheiden kunnen worden met geschikte filters.
• Co-imaging: In levende vliegen kon GCaMP8m (groen) en LSSmScarlet3 (rood) simultaan worden opgewekt met één laser (920 nm, 20% vermogen). De mushroom body structuren waren duidelijk zichtbaar zonder interferentie tussen de functionele calciumsignalen en de structurele marker.
• Helderheid: LSSmScarlet3 bleek zeer helder. In HEK293T-cellen was het signaal zelfs zo sterk dat de rode PMT bij vermogens boven de 25% verzadigde, wat aangeeft dat het eiwit zeer gevoelig is, zelfs bij lagere expressieniveaus.

4. Bijdragen en Significatie

• Vereenvoudiging van de opstelling: Dit werk bewijst dat het mogelijk is om functionele calciumdynamiek en anatomische context tegelijkertijd te visualiseren met één enkele laser (920 nm). Dit elimineert de noodzaak voor dure, complexe multi-laser systemen.
• Verhoogde kwaliteit van data: Door sequentiële scans te elimineren, wordt de temporale registratie tussen de kanalen perfect en wordt de fototoxiciteit voor het levende weefsel verminderd.
• Toepasbaarheid: De transgene vliegenlijn is direct beschikbaar en gevalideerd. De hoge helderheid van LSSmScarlet3 maakt het ook geschikt voor toepassingen waar expressieniveaus laag zijn, zoals fusie-eiwitten of subcellulaire lokalisatiemarkers.
• Toekomstperspectief: Deze aanpak opent de weg voor verdere ontwikkeling van LSS-varianten voor specifieke biologische markers, waardoor dual-channel imaging in Drosophila (en potentieel andere modellen) toegankelijker en robuuster wordt.

Conclusie
De auteurs hebben succesvol een praktische oplossing ontwikkeld voor dual-kanaals twee-photon imaging in Drosophila. Door gebruik te maken van de lang-Stokes-verschuiving van mScarlet3, kunnen onderzoekers nu structurele en functionele data verzamelen met een vereenvoudigde, kosteneffectieve en minder schadelijke imaging-opstelling.