On-lamella super-resolution cryo-CLEM for cryo-ET enabled by vacuum-free ultra-stable cryogenic fluorescence microscopy

De auteurs presenteren VULCROM, een vacuüm-vrije, ultra-stabiele cryo-fluorescentiemicroscoop die super-resolutie cryo-CLEM mogelijk maakt en zo de integratie van moleculaire specificiteit met cryo-elektronentomografie op lamella's verbetert.

De kern

De "Super-Microscoop" die Cellen in Bevroren Tijd Vastlegt

Stel je voor dat je een heel complexe stad wilt bestuderen, maar je kunt alleen maar naar de gebouwen kijken als ze volledig in ijs zijn bevroren. Dat is wat wetenschappers doen met cellen: ze bevriezen ze om hun natuurlijke staat te behouden. Vervolgens gebruiken ze een zeer krachtige microscoop (een elektronenmicroscoop) om de strakke architectuur van deze "ijsstad" te zien. Maar er is een groot probleem: deze bevroren stad is zo gedetailleerd, dat je de specifieke gebouwen (eiwitten) die je echt wilt zien, vaak niet kunt vinden. Het is alsof je in een witte sneeuwstorm staat en probeert een specifieke rode auto te vinden zonder dat je hem kunt zien.

Tot nu toe konden wetenschappers wel een lantaarnpaal gebruiken om de rode auto te vinden (fluorescentie), maar die lantaarn was niet scherp genoeg om te zien waar precies in de auto de bestuurder zat. Er was een gat in de resolutie: te wazig voor de details, maar te scherp voor de locatie.

De Oplossing: VULCROM

In dit artikel presenteren de onderzoekers een nieuwe uitvinding: VULCROM. Je kunt dit zien als een ultra-stabiele, bevroren camera die speciaal is ontworpen om deze twee werelden samen te brengen.

Hier is hoe het werkt, vertaald naar alledaagse termen:

1. De "Rustige Ijskast" (Stabiliteit)
Om super-scherpe foto's te maken van bevroren cellen, moet de microscoop perfect stil staan. Zelfs een trilling van een stofje kan de foto verpesten.

• De analogie: Stel je voor dat je probeert een foto te maken van een muggenpoot terwijl je op een trampoline staat. Dat lukt niet. Je moet op een massieve, stalen betonnen vloer staan.
• Hoe VULCROM dit doet: De onderzoekers hebben een systeem gebouwd dat geen dure, complexe vacuümpompen nodig heeft (wat vaak trillingen veroorzaakt). In plaats daarvan gebruiken ze een enorme tank vloeibare stikstof (zoals een gigantische thermoskan) en een dikke koperen staaf om de koude en stabiliteit vast te houden. Het systeem is zo stabiel dat het gedurende uren nauwelijks beweegt, alsof het op een onbeweeglijke rots staat. Hierdoor kunnen ze foto's maken met een scherpte van slechts enkele nanometers (duizend keer kleiner dan een haar).

2. De "Scharnierende Spiegel" (Aanpassing)
Soms zijn de bevroren cellen dik of ondoorzichtig, waardoor het beeld wazig wordt (zoals kijken door een beslagen raam).

• De analogie: Stel je voor dat je door een vervormd raam kijkt. Je kunt een speciale, slimme spiegel gebruiken die zijn vorm aanpast om het beeld weer recht te trekken.
• Hoe VULCROM dit doet: Ze hebben een vervormbare spiegel in de microscoop geplaatst. Deze spiegel kan zich in milliseconden vervormen om de "wazigheid" van het bevroren weefsel te corrigeren. Hierdoor worden de beelden weer kristalhelder, zelfs diep in de cel.

3. De "Magische Lantaarn" (Super-resolutie)
Normaal gesproken kunnen we in bevroren cellen geen individuele moleculen zien. Maar met VULCROM kunnen ze de moleculen laten "knipperen" (aan en uit gaan), net als een stervende kaars.

• De analogie: Stel je voor dat je in een donker bos staat met duizenden lantaarns die allemaal tegelijk branden. Je ziet alleen een grote, wazige gloed. Maar als je wacht tot ze één voor één oplichten en weer uitgaan, kun je precies zien waar elke lantaarn staat.
• Hoe VULCROM dit doet: Het systeem laat de eiwitten in de cel heel snel knipperen. Omdat de microscoop zo stabiel is, kan hij elke keer precies noteren waar een lantaarn oplicht. Door duizenden van deze flitsen samen te voegen, krijgen ze een kaart van de cel met een resolutie van ongeveer 10 nanometer.

Wat hebben ze ontdekt?

Met deze nieuwe "super-microscoop" hebben ze twee spannende dingen gedaan:

1. De "PML-bollen" in menselijke cellen: Ze hebben gekeken naar kleine bolletjes in de kern van menselijke cellen. Voorheen zag je in de bevroren beelden alleen een gladde, saaie plek. Met VULCROM zagen ze dat deze bollen een schil hebben van eiwitten en een lege kern in het midden. Het is alsof je eindelijk het binnenste van een ei kunt zien zonder het te breken.
2. De "Afvalverwerkers" in planten: Ze keken naar een plant die een eiwit maakt dat belangrijk is voor het opruimen van afval in de cel (autofagie). Ze zagen precies waar deze eiwitten zich ophopen: bij de "postkantoren" (Golgi-apparaat) en bij de "afvalcontainers" (autofagomen). Dit helpt ons te begrijpen hoe planten ziektes bestrijden.

Waarom is dit belangrijk?

VULCROM is niet alleen een nieuwe microscoop; het is een brug. Het verbindt de wereld van de "locatie" (waar zit het eiwit?) met de wereld van de "structuur" (hoe ziet het eruit?). Omdat het systeem flexibel is en geen vacuüm nodig heeft, kunnen andere laboratoria het makkelijker gebruiken en aanpassen aan hun eigen onderzoek.

Kortom: Wetenschappers hebben een nieuwe, superstabiele camera gebouwd die bevroren cellen met een ongekende scherpte fotografeert. Hierdoor kunnen we eindelijk zien hoe de kleine machines in onze cellen precies in elkaar zitten, terwijl ze in hun natuurlijke, bevroren staat verkeren.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Cryo-correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (cryo-CLEM) combineert de specifieke labeling van eiwitten via fluorescentie met de atomaire resolutie van cryo-elektronentomografie (cryo-ET). Hoewel super-resolutie fluorescentiemicroscopie (cryo-SR-FM) de resolutiegat tussen deze technieken kan overbruggen, zijn er aanzienlijke obstakels die de volledige integratie met structurele celbiologie belemmeren:

1. Mechanische stabiliteit: Er ontbreekt een dedicated cryo-fluorescentiemicroscoop met voldoende mechanische stabiliteit om hoogwaardige super-resolutiedata te verzamelen zonder drift.
2. Compatibiliteit: Bestaande systemen met vacuümgeïsoleerde cryostaten bieden wel stabiliteit, maar zijn vaak te complex, onflexibel en moeilijk te integreren in standaard cryo-ET-workflows (zoals FIB-milling en lift-out).
3. Contaminatie: Het opbouwen van ijsverontreiniging tijdens het transferproces of tijdens het beeldvormen is een groot risico voor vitrifieerde specimens.
4. Fotofysica: Er is een gebrek aan inzicht in het gedrag van enkele moleculen onder cryo-condities, waarbij trage schakelkinetiek lange opnametijden vereist, wat extreme stabiliteit op tijdschalen van minuten tot uren eist.

Methodologie: VULCROM

De auteurs introduceerden VULCROM (Vacuum-free Ultra-stable Cryogenic Optical Microscope), een nieuw microsysteem dat de stabiliteit van een vacuüm-cryostaat combineert met de flexibiliteit van een open, vacuüm-vrij systeem.

• Ontwerp en Koeling: Het systeem maakt gebruik van passieve koeling via een grote vloeibare stikstof (LN2) reservoir (12 L) verbonden met de cryokamer via een massieve koperen staaf. Dit creëert een enorme thermische inertie (7.500 J/K), wat temperatuurschommelingen en focusdrift minimaliseert zonder pompen of actieve koeling.
• Objectieflens: De objectieflens (100x, 0.9 NA) is direct gemonteerd binnen de cryokamer op een Macor-plate. De lens wordt op kamertemperatuur gehouden en thermisch geïsoleerd van de koude stikstofatmosfeer om thermische lensvervorming te voorkomen.
• Ijscontaminatie: Een positieve druk van stikstofgas (afkomstig van de LN2-verdamping) wordt door de kamer geleid om de instroom van vochtige lucht en ijsvorming te voorkomen.
• Stabilisatie en Optica:
  • Piezo-positionaloren binnen de kamer zorgen voor positionering.
  • Een vervormbare spiegel (Deformable Mirror) in het detectiepad maakt adaptieve optica (AO) mogelijk om optische aberraties te corrigeren, zowel inherent aan het systeem als veroorzaakt door dikke specimens.
  • Het systeem is compatibel met de Leica Transfer Shuttle en Autogrid-cartridges, wat naadloze overdracht naar FIB-milling en TEM mogelijk maakt.

Belangrijkste Bijdragen

1. Ontwikkeling van VULCROM: Een dedicated cryo-SR-CLEM-opstelling die vacuüm-vrij is, maar toch stabiliteit in het sub-nanometerbereik biedt.
2. Validatie van Stabiliteit: Bewijs dat het systeem drift onder de 1 nm/min bereikt en residuale drift (na correctie) in het bereik van enkele nanometers (lateraal) en ~11 nm (axiaal) houdt over perioden van uren.
3. Integratie in Workflows: Demonstratie van volledige compatibiliteit met geavanceerde cryo-ET workflows, waaronder FIB-milling van lamellen en seriele cryo-lift-out uit weefsels.
4. Adaptieve Optica: Implementatie van een sensorloze AO-correctieroutine die de beeldkwaliteit en intensiteit in dikke specimens aanzienlijk verbetert.

Resultaten

• Stabiliteitsmetingen: Metingen aan fluorescente microbollen toonden een drift van <1 nm/min. Na driftcorrectie bleef de residuale drift 4,2 nm (x), 3,5 nm (y) en 11,3 nm (z). Bij korte tijdsintervallen (50 ms) was de frame-tot-frame drift slechts ~3 nm.
• Enkele Molecule Fotofysica: Het systeem kon het gedrag van Atto647N-kleurstoffen gedurende ~2,5 uur volgen. Er werden snelle milliseconde-blinking en langzamere on/off-fasen (seconden tot uren) waargenomen, wat suggereert dat er een relatie is tussen deze verschillende tijdschalen.
• Adaptieve Optica (AO): AO-correctie verbeterde de intensiteit in breedveldbeelden met ~20% en in cryo-SOFI-beelden (Super-resolution Optical Fluctuation Imaging) met een factor 4, waardoor zwakke signalen in dikke cellen (20 µm diep) zichtbaar werden.
• Biologische Toepassingen (Cryo-SR-CLEM):
  • PML-lichaampjes (Zoogdiercellen): In FIB-gemaalde lamellen van menselijke fibroblasten werd de nanoscale architectuur van YFP-gelabelde PML-lichaampjes opgelost. Cryo-SR-CLEM onthulde een schaalstructuur rond een kern, wat onmogelijk was te identificeren met cryo-ET alleen. De lokale precisie bedroeg gemiddeld 7,7 nm.
  • ATG9-eGFP (Plantweefsel): In een seriele cryo-lift-out lamella van Nicotiana benthamiana werd de verdeling van ATG9-eGFP in autophagosomes en het Golgi-apparaat in kaart gebracht. Dit leverde nieuwe inzichten op in de rol van ATG9 in plantimmuniteit. De lokale precisie was hier 21,1 nm.

Betekenis en Impact

Dit werk vormt een doorbraak in de instrumentatie voor structurele celbiologie:

• Toegankelijkheid: Door het vacuüm-vrije ontwerp is het systeem eenvoudiger, goedkoper en flexibeler dan bestaande vacuüm-cryostaten, terwijl het dezelfde stabiliteit biedt.
• Resolutieverbetering: Het overbrugt de resolutiegat tussen cryo-EM en cryo-lichtmicroscopie, waardoor specifieke eiwitcomplexen in hun native omgeving met ~10 nm resolutie kunnen worden gelokaliseerd.
• Workflow-integratie: Het maakt cryo-SR-CLEM mogelijk als een routine-stap in complexe workflows zoals FIB-milling en lift-out, wat essentieel is voor het bestuderen van zeldzame gebeurtenissen in dierlijke en plantaardige weefsels.
• Toekomstperspectief: Het systeem opent de deur voor geavanceerde toepassingen zoals cryo-immersiebeeldvorming en 4Pi-configuraties, en biedt een platform voor fundamenteel onderzoek naar cryo-fotofysica.

Samenvattend stelt VULCROM onderzoekers in staat om super-resolutie fluorescentiebeelden te combineren met cryo-ET in een robuust, stabiel en flexibel systeem, wat de weg vrijmaakt voor nieuwe inzichten in de moleculaire architectuur van cellen.