Serine proteases are required to activate influenza D virus haemagglutinin-esterase fusion (HEF) protein

De studie toont aan dat serineproteasen zoals HAT, swAT en matriptase de HEF-eiwitten van influenza D-virus activeren, wat suggereert dat proteasespecificiteit niet de beperkende factor is voor de replicatie van dit virus in de menselijke bovenste luchtwegen.

De kern

De Sleutel tot de Deur: Hoe het Influenza D-virus binnenkomt

Stel je voor dat een virus als een dief is die een huis wil inbreken. Het huis is een cel in je lichaam (of van een dier). De dief heeft een speciale sleutel nodig om de voordeur open te maken. Bij het Influenza D-virus (een nieuw soort griepvirus dat vooral bij ratten voorkomt, maar ook bij koeien en varkens) is die sleutel een eiwit op het oppervlak van het virus genaamd HEF.

Maar hier is het probleem: de sleutel die het virus bij de geboorte krijgt, is nog niet klaar voor gebruik. Het is alsof de sleutel in een stukje plastic zit dat nog in de fabriek is verpakt. De dief kan er niet mee openen zolang hij die plastic verpakking niet verwijdert.

De "Schaar" die de verpakking verwijdert

In de biologie heet dit proces "splitsen" of "activatie". Het virus heeft een schaar nodig (een enzym of protease) om de plastic verpakking van de sleutel te knippen. Pas als de schaar de verpakking heeft verwijderd, kan de sleutel de deur openen en kan het virus de cel binnendringen.

De vraag die de onderzoekers in dit artikel wilden beantwoorden was: Welke schaar in het lichaam knipt deze verpakking open?

Bij andere griepvirussen (zoals de menselijke griep) weten we dat bepaalde scharen in de longen en luchtwegen deze taak doen. Maar bij Influenza D wisten ze het niet zeker.

Het Experiment: Een Proefpoppetje

De onderzoekers hebben een slimme truc gebruikt. Ze hebben geen echt gevaarlijk virus gebruikt, maar een pseudovirus (een nepvirus).

• Het idee: Ze namen een onschadelijk virus (een leeg busje) en kleefden de "sleutel" (het HEF-eiwit) van het Influenza D-virus erop.
• De test: Ze lieten dit nepvirus proberen een cel binnen te gaan, maar ze gaven het virus verschillende soorten "schaar" mee. Ze keken welke schaar het werk het beste deed.

De Resultaten: Wie is de held?

De onderzoekers testten verschillende bekende scharen:

1. HAT (Menselijke luchtweg-schaar): Dit bleek een superheld te zijn. Wanneer ze deze schaar toevoegden, ging het nepvirus heel makkelijk de cel binnen.
2. TMPRSS2 (Een andere bekende schaar): Deze schaar deed niets. Het virus bleef buiten.
3. SwAT (De varkens-versie van HAT): Omdat Influenza D vaak bij varkens en koeien voorkomt, keken ze ook naar de schaar die varkens hebben. Het bleek dat de varkens-schaar (SwAT) net zo goed werkt als de menselijke schaar.

De grote ontdekking: Het maakt niet uit of je een mens of een varken bent; de "schaar" die het virus nodig heeft, is in beide gevallen dezelfde soort. Dit betekent dat het virus makkelijk van varkens naar mensen (en andersom) kan springen, zolang die specifieke schaar maar aanwezig is.

De "Eigen Schaar" van de Cel

Een ander interessant punt was dat ze merkten dat in bepaalde cellen (de MDCK-cellen, vaak gebruikt in labs) ze geen extra schaar hoefden toe te voegen. Het virus kon zichzelf al openmaken.

• De vergelijking: Het is alsof de cel zelf een eigen schaar in de keuken heeft hangen (een eiwit genaamd matriptase). Als de cel die schaar al heeft, hoeft het virus niet te wachten op een externe hulp. Dit verklaart waarom het virus in sommige cellen heel snel groeit zonder dat je er iets aan hoeft te doen.

Waarom is dit belangrijk?

1. Geen barrière tussen soorten: Omdat de "schaar" die het virus nodig heeft (HAT/SwAT) zowel bij mensen als bij varkens voorkomt, is er geen biologische muur die het virus tegenhoudt om van dier op mens over te springen.
2. Geen ziekte bij mensen (nog niet): Hoewel het virus wel binnen kan komen in menselijke cellen, is het nog niet bewezen dat het mensen ziek maakt. Het virus heeft waarschijnlijk nog andere obstakels.
3. Toekomstige medicijnen: Als we weten welke schaar het virus nodig heeft, kunnen wetenschappers misschien een medicijn ontwikkelen dat die specifieke schaar "plat" legt. Dan kan het virus zijn sleutel niet meer openmaken en kan het niet meer binnenkomen.

Samenvatting in één zin

Dit onderzoek laat zien dat het Influenza D-virus een specifieke "schaar" nodig heeft om te kunnen infecteren, en dat zowel mensen als varkens deze schaar hebben, wat betekent dat het virus potentieel tussen deze soorten kan wisselen, maar dat we nu precies weten hoe het werkt.

Technische samenvatting

Technische Samenvatting: Serineproteasen zijn vereist voor de activatie van het influenza D-virus HEF-proteïne

1. Het Probleem
Influenza D-virus (IDV) is een recent geïdentificeerd lid van de Orthomyxoviridae-familie, waarbij runderen de primaire reservoirhost zijn. Hoewel IDV wereldwijd voorkomt, is er geen bevestiging dat het menselijke ziekte veroorzaakt. Een cruciaal stadium in de levenscyclus van influenza-virussen is de proteolytische splitsing van het oppervlakteglycoproteïne (bij IDV het HEF-proteïne) van een precursor (HEF0) naar twee subeenheden (HEF1 en HEF2). Deze splitsing is noodzakelijk voor de fusie van het virale omhulsel met het endosoom en dus voor infectiviteit.
Hoewel de proteasen die de hemagglutinine (HA) van influenza A (IAV) activeren goed bestudeerd zijn (o.a. TMPRSS2 en HAT), was het onbekend welke specifieke gastheerproteasen verantwoordelijk zijn voor de activatie van het IDV-HEF-proteïne. Het identificeren van deze proteasen is essentieel om de interactie tussen virus en gastheer en de mogelijke restrictie van IDV-replicatie in de menselijke luchtwegen te begrijpen.

2. Methodologie
De onderzoekers gebruikten een pseudotyped virus (PV) systeem om de activatie van IDV-HEF te bestuderen zonder het risico van replicatie-competente virussen.

• Pseudotyped Virussen (PV's): Lentivirale reporter-virussen werden geproduceerd in HEK 293T-cellen. Deze PV's droegen de HEF-oppervlakteproteïnes van influenza C (ICV) en twee IDV-stammen (D/swine/Italy/2015 en D/bovine/France/2014).
• Co-transfectie: De producerende cellen werden geco-transfecteerd met plasmiden die verschillende type II transmembrane serineproteasen tot expressie brachten:
  • Menselijk: HAT (Human Airway Trypsin-like protease) en TMPRSS2.
  • Varkens (swine): swAT (swine HAT) en swTMPRSS2.
  • Matriptase (TMPRSS14).
• Transductie-assay: De geproduceerde PV's werden gebruikt om swine testiculaire (ST) cellen te transduceren. De efficiëntie van infectie (transductietitre) werd gemeten via luciferase-activiteit.
• Replicatie-studies: Infectieuze IDV en IAV (A/PR8) werden gekweekt in verschillende cellijnen (MDCK II, A549, MDBK) met en zonder exogeen toegevoegd trypsine om de rol van endogene proteasen te onderzoeken.
• Sequentie-analyse: De splitsingsplaatsen van de HEF-proteïnes werden gealigneerd en vergeleken met bekende sequenties.

3. Belangrijkste Bijdragen

• Eerste identificatie van activatorproteasen voor IDV: Het artikel identificeert voor het eerst specifiek welke proteasen het IDV-HEF-proteïne kunnen activeren.
• Vergelijking Mens-Varken: Het onderzoek vergelijkt de efficiëntie van menselijke en varkensproteasen, wat relevant is voor de zoonotische potentie en de gastheerrestrictie van IDV.
• Rol van Matriptase: Het toont aan dat matriptase, een protease dat endogeen wordt uitgedrukt in MDCK II-cellen, IDV-HEF kan splitsen, wat verklaart waarom exogeen trypsine niet altijd nodig is voor replicatie in bepaalde cellijnen.

4. Resultaten

• HAT en swAT zijn cruciaal: De transductietiters waren significant hoger wanneer de PV's werden geproduceerd in aanwezigheid van HAT (menselijk) of swAT (varkens). Dit geldt voor zowel ICV als IDV.
• TMPRSS2 is inefficiënt: In tegenstelling tot wat soms bij IAV het geval is, leek TMPRSS2 (en swTMPRSS2) het IDV-HEF-proteïne niet efficiënt te splitsen. De transductietiters waren vergelijkbaar met de negatieve controles (geen protease).
• Matriptase activatie: Matriptase kon IDV-HEF ook splitsen, zij het met een lagere efficiëntie dan HAT. Dit verklaart waarom IDV (en IAV H1N1) zich kan repliceren in MDCK II-cellen zonder toegevoegd trypsine; deze cellen expresseren endogeen matriptase.
• Celtype-afhankelijkheid: In A549 (menselijk long) en MDBK (rund) cellen was exogeen trypsine wel nodig voor meerdere replicatiecycli, wat aangeeft dat deze cellen minder endogene proteasen hebben die specifiek voor IDV werken.
• Sequentie: De splitsingsplaats van IDV-HEF is monobasisch (na een enkel lysine of arginine), vergelijkbaar met ICV en laag-pathogeen IAV, wat de afhankelijkheid van type II serineproteasen bevestigt.

5. Significantie en Conclusie

• Gastheerrestrictie: De belangrijkste conclusie is dat de specificiteit van proteasen geen beperkende factor is voor de replicatie van IDV in de menselijke bovenste luchtwegen. Omdat zowel menselijke HAT als varkensswAT het virus efficiënt activeren, zou IDV theoretisch de menselijke luchtwegen kunnen binnendringen en repliceren, mits andere factoren (zoals receptorbeschikbaarheid) het toelaten.
• Klinische implicaties: Het begrijpen van welke proteasen influenza-virussen activeren, biedt nieuwe doelwitten voor antivirale therapieën. Selectieve remmers van matriptase of HAT zouden potentieel kunnen worden ingezet om de replicatie van influenza-virussen te blokkeren.
• Methodologische validatie: Het studie bevestigt dat pseudotyped virussen een krachtig hulpmiddel zijn om de protease-afhankelijkheid van nieuwe influenza-stammen veilig en snel te onderzoeken.

Kortom, dit onderzoek onthult dat IDV afhankelijk is van type II serineproteasen (met name HAT en zijn varkenshomoloog) voor activatie, en dat het ontbreken van een specifieke menselijke protease-restrictie suggereert dat andere factoren de beperkte menselijke pathogeniciteit van IDV verklaren.