Expanding the genetic code with diverse backbone structures across diverse sequence contexts

Deze studie beschrijft de ontwikkeling van geëvolueerde orthogonale tRNA's die de selectieve en efficiënte in vivo incorporatie van diverse niet-canonele monomeren met variërende backbonestructuren in bijna alle sequentiekontexten mogelijk maken, waardoor de synthese van functioneel verrijkte eiwitten en macrocycli wordt vergemakkelijkt.

De kern

Het Bouwvak van het Leven: Hoe Wetenschappers Nieuwe Steensoorten voor DNA Ontdekken

Stel je voor dat het leven een enorme bouwplaats is. De cellen in ons lichaam zijn de bouwvakkers, en hun blauwdruk is DNA. Normaal gesproken werkt dit systeem met een vaste set van 20 bouwstenen (aminozuren) om eiwitten te maken. Deze eiwitten zijn de machines, muren en gereedschappen van de cel.

Maar wat als je die bouwvakkers meer dan 20 soorten stenen zou geven? Wat als je ze stenen kon geven die er anders uitzien, een andere vorm hebben of zelfs een andere "ruggegraat" hebben? Dan zouden ze gebouwen kunnen maken die sterker zijn, die niet kapotgaan in de regen, of die nieuwe, magische krachten hebben.

Dit is precies wat deze wetenschappers hebben gedaan. Ze hebben de genetische code van bacteriën uitgebreid met nieuwe, onnatuurlijke bouwstenen. Maar er was een groot probleem: de bouwvakkers wisten niet hoe ze met die nieuwe stenen moesten werken.

Hier is hoe ze dat oplosten, verteld als een verhaal:

1. Het Probleem: De Verkeerde Sleutel

In de bouwplaats van de cel is er een speciale sleutelbewaarder (een enzym genaamd synthetase) die de bouwstenen aan de juiste sleutels (tRNA) bevestigt. Normaal gesproken past deze sleutel alleen op de 20 standaardstenen.

De wetenschappers wilden nu nieuwe stenen gebruiken, zoals stenen met een dubbele knik (β2-aminozuren) of stenen in een ringvorm (N-cyclische aminozuren). Maar de bestaande sleutelbewaarsers wisten deze nieuwe stenen niet te herkennen. Ze probeerden het met een slimme truc: ze lieten de sleutelbewaarsers in een wedstrijd deelnemen. Alleen degenen die het beste met de nieuwe stenen konden werken, kregen een prijs (meer overleving in de cel). Zo vonden ze nieuwe, getrainde sleutelbewaarsers die deze rare stenen wel konden vastpakken.

2. Het Grote Obstakel: De "Buurt" maakt het uit

Toen ze eindelijk de juiste sleutelbewaarsers hadden, dachten ze: "Super, nu kunnen we overal die nieuwe stenen gebruiken!" Maar toen ze het probeerden, bleek het een ramp.

Het bleek dat de bouwvakkers (de ribosomen) heel kieskeurig waren over waar ze de nieuwe stenen plaatsten.

• Als je een nieuwe steen zette tussen twee "normale" stenen die goed bij elkaar pasten, ging het prima.
• Maar als je de nieuwe steen zette tussen twee stenen die niet goed bij elkaar pasten (een slechte "buurt"), weigerden de bouwvakkers om te werken. De constructie viel in elkaar.

Het was alsof je een nieuwe, zware granieten steen probeerde te leggen in een muur van zachte klei. Soms paste hij, maar vaak viel de muur eromheen in. Ze ontdekten dat voor sommige nieuwe stenen, het maar in 1 op de 100 situaties lukte om ze in te bouwen. Dat is veel te weinig om iets nuttigs mee te bouwen.

3. De Oplossing: De "Super-Bouwvakkers"

Hoe los je dit op? Je kunt de bouwvakkers niet veranderen (dat is te ingewikkeld), maar je kunt wel de sleutels aanpassen!

De wetenschappers lieten de sleutels (tRNA) evolueren. Ze maakten duizenden variaties van deze sleutels en selecteerden alleen diegenen die het beste werkten, zelfs in de moeilijke buurten.

• Ze vonden een nieuwe versie van de sleutel die als een superlijm werkte.
• Deze nieuwe sleutel kon de bouwvakker helpen om de nieuwe steen vast te houden, zelfs als de buren (de andere stenen) niet zo vriendelijk waren.

Het resultaat?

• Waar het voorheen maar in 1% van de gevallen lukte, lukte het nu in 95% van de gevallen.
• Ze konden de nieuwe stenen nu overal in de muur plaatsen, ongeacht de buurt.
• De bouwefficiency steeg met wel 40 keer in de moeilijkste situaties!

4. Het Grote Doel: Magische Ringen

Waarom doen ze dit? Om iets moois te bouwen: macrocycli.
Stel je voor dat je een lange touwlijn bouwt met die nieuwe stenen, en je knoopt het uiteinde aan het begin vast. Je krijgt een ring. Omdat je nu nieuwe soorten stenen hebt (met andere vormen en stijfheid), kun je ringen maken die:

• Niet worden opgegeten door maagzuur (handig voor medicijnen).
• Zich vastklampen aan ziektekiemen.
• Nieuwe vormen aannemen die de natuur nooit heeft bedacht.

De wetenschappers toonden aan dat ze met hun nieuwe, getrainde sleutels nu ringen konden maken met al deze nieuwe stenen, zelfs in situaties waar het voorheen onmogelijk was.

Samenvatting

In het kort:

1. Ze vonden nieuwe manieren om nieuwe bouwstenen in het DNA-systeem te steken.
2. Ze ontdekten dat het systeem heel gevoelig is voor waar je die stenen plaatst (de context).
3. Door de sleutels (tRNA) te verbeteren, maakten ze het systeem zo flexibel dat het nieuwe stenen overal kon gebruiken.
4. Hierdoor kunnen we nu nieuwe medicijnen en materialen ontwerpen die de natuur zelf niet kan maken.

Het is alsof ze eerst een sleutel vonden die een nieuw slot opende, en toen ontdekten dat de deur soms vastzat. Door de deurklink (de tRNA) te vervangen door een krachtigere versie, konden ze de deur nu altijd openen, waar ze ook stonden.

Technische samenvatting

Probleemstelling

De uitbreiding van de genetische code om niet-kanonieke monomeren (ncMs) met diverse ruggegraatsstructuren (buiten de standaard $\alpha$-L-aminozuren) in te bouwen, is een grote uitdaging. Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij het in vitro acyleren van tRNA's met deze monomeren, is de in vivo, gen-gecodeerde, site-specifieke incorporatie in levende cellen uiterst moeilijk gebleken.
Eerdere studies toonden aan dat bepaalde synthetases tRNA's konden acyleren met ncMs (zoals $\beta^2$- en $\beta^3$-aminozuren), maar het was onduidelijk of deze monomeren daadwerkelijk in eiwitten konden worden ingebouwd tijdens translatie. Bovendien bleek de efficiëntie van deze incorporatie sterk afhankelijk te zijn van de sequentiecontext (de codons direct voor en na het amber-codon), waardoor veel sequenties ongeschikt bleken voor de inbouw van deze monomeren.

Methodologie

De auteurs hanteerden een geïntegreerde aanpak die bestond uit drie hoofdfasen:

1. Ontdekking van orthogonale synthetases via tRNA-display:

   • Ze gebruikten een tRNA-display bibliotheek met varianten van de Methanosarcina mazei pyrrolysyl-synthetase (MmPylRS).
   • Selecties werden uitgevoerd in aanwezigheid en afwezigheid van nieuwe monomeren: $\beta^2$-aminozuren, niet-kanonieke N-cyclische aminozuren, malonzuurderivaten en $\alpha,\alpha$-disubstitueerde aminozuren.
   • Dit resulteerde in de identificatie van specifieke PylRS-varianten die hun cognate tRNA (tRNAPyl) selectief acyleren met deze nieuwe monomeren in vivo.

2. Systematische analyse van sequentie-afhankelijkheid:

   • De auteurs testten de incorporatie van vier klassen van ncMs ($\beta^3$, $\beta^2$, N-cyclisch, en $\alpha,\alpha$-disubstitueerd) op negen verschillende posities in een sfGFP-reporter.
   • Ze construeerden een uitgebreide bibliotheek van 4096 "codon context reporters" (waarbij de codons direct voor en na het amber-codon varieerden) om de invloed van de lokale sequentie op de incorporatie-efficiëntie kwantitatief te meten via flowcytometrie (FACS) en Next-Generation Sequencing (NGS).

3. Gerichte evolutie van orthogonale tRNA's:

   • Om de beperkingen van de sequentie-afhankelijkheid te overwinnen, evolueerden ze de orthogonale tRNA's zelf.
   • Ze creëerden saturatiebibliotheken van tRNAPyl-varianten, gericht op regio's die interageren met EF-Tu, het ribosoom en de mRNA-binding (acceptorstam, T-stam, D-arm, anticodon-arm).
   • Deze bibliotheken werden geselecteerd op basis van GFP-fluorescentie in aanwezigheid van de specifieke ncM, waarbij ze gebruikmaakten van FACS om de meest actieve varianten te sorteren.
   • Ze evolueerden tRNA's specifiek voor verschillende monomeren en testten vervolgens of deze varianten de incorporatie in "moeilijke" sequentiecontexten konden verbeteren.

Belangrijkste Bijdragen en Resultaten

• Ontdekking van nieuwe synthetases: De auteurs identificeerden PylRS-varianten die tRNA's specifiek acyleren met 11 nieuwe ncMs uit vijf chemische klassen. Dit omvatte de eerste in vivo incorporatie van $\beta^2$-aminozuren en niet-kanonieke N-cyclische aminozuren in eiwitten.
• Sequentie-afhankelijkheid bevestigd: De studie toonde aan dat de incorporatie van ncMs met een niet-kanonieke ruggegraat extreem gevoelig is voor de sequentiecontext. Met de oorspronkelijke (wildtype) tRNA's werd incorporatie in veel contexten gemeten op <1% van de verwachte efficiëntie, en in sommige gevallen leidde het zelfs tot een negatief effect op de translatie (dominant negatief gedrag).
• tRNA-evolutie verbetert efficiëntie en bereik:
  • Door tRNA's te evolueren (bijv. $\beta3\_tRNAPyl$, $\beta2\_tRNAPyl$, $CA\_tRNAPyl$, $aa\_tRNAPyl$), konden ze de incorporatie-efficiëntie met tot wel 40-voudig verhogen.
  • De geëvolueerde tRNA's maakten incorporatie mogelijk in een veel breder scala aan sequentiecontexten. Waar wildtype tRNA's slechts 0,6% tot 26% van de contexten ondersteunden, ondersteunden de geëvolueerde varianten tot wel 95,5% van de geteste sequentiecontexten.
  • Specifiek voor $\beta^3$-aminozuren ($\beta3\_v2\_tRNAPyl$) werd een 40-voudige toename in fluorescentie waargenomen in moeilijke contexten vergeleken met wildtype.
• Synthese van macrocycli: De auteurs demonstreerden de praktische toepassing door genetisch geprogrammeerde synthese van macrocyclische peptiden met diverse niet-kanonieke ruggegraten ($\beta^2$, $\beta^3$, N-cyclisch, $\alpha,\alpha$-disubstitueerd) in levende cellen. De geëvolueerde tRNA's maakten het mogelijk om macrocycli te produceren in sequentiecontexten die met wildtype tRNA's niet toegankelijk waren.

Betekenis en Impact

Deze studie vormt een fundamentele doorbraak in het veld van de synthetische biologie en de uitbreiding van de genetische code:

1. Paradigmaverschuiving: Het bewijst dat het direct ontdekken van synthetases die tRNA's acyleren, de sleutel is om vervolgens andere translatiecomponenten (zoals tRNA's) te selecteren die de incorporatie van deze monomeren mogelijk maken.
2. Overcoming Context Dependence: Het lost het probleem op dat de inbouw van exotische monomeren eerder beperkt was tot zeer specifieke sequenties. De geëvolueerde tRNA's fungeren als een universele oplossing om de "sequentiemuur" te doorbreken.
3. Toekomstige Toepassingen: Deze technologie opent de deur tot het ontwerpen en fabriceren van eiwitten, peptiden en macrocycli met volledig nieuwe chemische eigenschappen (zoals proteaseresistentie, nieuwe katalytische activiteiten en unieke structurele vouwingen) die niet mogelijk zijn met de natuurlijke genetische code. Het stelt onderzoekers in staat om vrij te combineren en te selecteren uit een veel grotere chemische ruimte in levende organismen.

Kortom, de auteurs hebben een robuust platform ontwikkeld dat de genetische code effectief uitbreidt naar monomeren met complexe ruggegraatsstructuren, ongeacht de sequentiecontext waarin ze moeten worden ingebouwd.