Cooling fast and slow: Characterising the effects of vitrification in cryo-EM and the subsequent recovery of equilibrium populations

Dit onderzoek toont aan dat vitrificatie tijdens cryo-EM de biomoleculaire ensemble niet fundamenteel verandert en dat een thermodynamisch inferentieframework kan worden gebruikt om evenwichtspopulaties te herstellen, waardoor cryo-EM een betrouwbare techniek blijft voor het bestuderen van biomoleculaire ensembles.

De kern

Stel je voor dat je een danszaal hebt vol met dansers (deze zijn onze eiwitten of biomoleculen). Deze dansers bewegen constant, draaien, springen en wisselen van partner. Ze zijn levendig en dynamisch.

Nu wil je een foto maken van al deze verschillende dansposities om te begrijpen hoe ze bewegen. Maar er is een probleem: de camera die je gebruikt (de cryo-EM-microscoop) werkt alleen in een vacuüm. Als je de dansers in hun normale, vloeibare omgeving zou plaatsen, zouden ze verdampen en zou de camera het niet overleven.

De oplossing: Het "Sneeuwbol"-effect
Om dit op te lossen, gooien de wetenschappers de dansers in een ijskoude vloeistof (vloeibaar stikstof of ethaan). Dit gebeurt zo snel dat het water rondom de dansers geen tijd heeft om kristallen te vormen (zoals sneeuwvlokken), maar in plaats daarvan verandert in een soort sneeuwbol of glas. Dit noemen we vitrificatie. De dansers worden plotseling "bevroren" in hun huidige pose, ingekapseld in dit glazen water, zodat je ze kunt fotograferen.

Het grote vraagteken
Maar hier zit een addertje onder het gras:

1. Te snel of te traag? Als je te langzaam afkoelt, vormen er zich grote ijskristallen die de dansers kapot maken of van hun plek duwen. Als je te snel afkoelt, krijg je misschien een foto, maar is het een eerlijke foto?
2. De "Valse" Foto: Misschien bevroor je de dansers op een moment dat ze net een rare, onnatuurlijke pose aannamen omdat ze door de kou in paniek raakten? Of misschien verdwenen sommige dansers volledig omdat ze niet snel genoeg konden reageren?

De vraag is: Is de foto die we maken in de microscoop een eerlijke weergave van hoe de dansers er normaal uitzien, of is het een vervormde versie door de kou?

Wat deden de onderzoekers?
Om dit uit te zoeken, lieten ze een supercomputer "dansen" in plaats van echte eiwitten. Ze simuleerden het miniproteïne "Trp-cage" (een heel klein dansertje) en keken wat er gebeurde toen ze het in verschillende snelheden afkoelden.

Ze ontdekten een paar belangrijke dingen:

• Het water doet het werk: Het water dat de danser omringt, verandert in glas op precies dezelfde manier, of er nu een danser in zit of niet. De danser zelf verstoort het proces niet.
• De "Stevige" vs. "Wankelende" Dansers: Sommige poses (conformaties) zijn heel stabiel. Als je deze bevroert, blijven ze eruitzien zoals ze hoorden. Andere poses zijn heel wankel en snel veranderlijk. Bij het bevriezen kunnen deze wankelende poses verdwijnen of veranderen, alsof ze door de kou "vastlopen" in een verkeerde houding.

De Magische Rekenmethode
Dit is het belangrijkste deel: de onderzoekers bedachten een slimme wiskundige truc (een thermodynamisch raamwerk).
Stel je voor dat je een foto maakt van een menigte mensen, maar door de kou zijn sommige mensen uit de foto verdwenen of hebben ze hun hoed op een rare manier opgezet. De onderzoekers hebben nu een formule bedacht die je kunt gebruiken om op basis van die "bevroren" foto de oorspronkelijke menigte te reconstrueren. Ze kunnen berekenen: "Oké, in de bevroren foto zien we 10 mensen in pose A, maar door de kou zijn er waarschijnlijk 5 extra mensen in die pose verdwenen. Laten we dat er weer bij optellen."

De conclusie
Dit onderzoek is een groot nieuwsbericht voor de wetenschap. Het betekent dat we ons geen zorgen hoeven te maken dat cryo-EM ons een leugen vertelt over hoe eiwitten bewegen. Zolang we deze slimme rekenmethode gebruiken om de effecten van het bevriezen te corrigeren, kunnen we cryo-EM gebruiken om niet alleen statische foto's te maken, maar om de hele dans van de biomoleculen te reconstrueren.

Kortom: We kunnen nu met vertrouwen de "sneeuwbollen" bekijken en weten precies hoe de dansers eruit zagen voordat ze bevroren werden.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Enkelpartikel cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) heeft revolutionaire doorbraken geboekt in het bepalen van structuren van biomoleculen met bijna atomaire resolutie. Omdat elektronenmicroscopie een hoog vacuüm vereist, kunnen vloeibare monsters niet direct worden afgebeeld. In plaats daarvan worden monsters snel afgekoeld door ze in een cryogeen te "plungen", waardoor het water vitrificeert (overgaat in een glasachtige toestand) en de biomoleculen in een glasachtige matrix worden ingevroren.

Het centrale probleem is dat de effecten van dit vitrificatieproces op het ensemble van biomoleculen onbekend zijn. Het is onduidelijk of de snelle afkoeling de conformationele verdeling (de verzameling van verschillende vormen) van de biomoleculen verstoort. Dit maakt het moeilijk om betrouwbare conformationele ensembles af te leiden uit cryo-EM-data, wat essentieel is voor het begrijpen van de dynamiek van biomoleculen.

Methodologie

Om de effecten van vitrificatie te bestuderen, hebben de auteurs een uitgebreide computergestudeerde aanpak gebruikt:

• Moleculaire Dynamica (MD) Simulaties: Er werden extensieve MD-simulaties uitgevoerd van het Trp-cage miniproteïne, zowel in evenwicht als tijdens het afkoelingsproces. De totale simulatietijd bedroeg meer dan 50 milliseconden.
• Afkoelsnelheden: Zeven verschillende afkoelsnelheden werden gesimuleerd, variërend over drie ordes van grootte. De langzaamste afkoelsnelheden kwamen overeen met experimentele waarden uit de praktijk.
• Analyse van Water en Eiwit:
  • De mobiliteit van moleculen en de dichtheid-temperatuur toestandsvergelijkingen voor water (met en zonder eiwit) werden geanalyseerd om te bepalen of het eiwit de vitrificatie van water beïnvloedt.
  • Om conformationele veranderingen te volgen, werd een Markov State Model (MSM) opgesteld voor Trp-cage, gebaseerd op 5,4 milliseconden aan evenwichtsdata bij 277 K.
• Thermodynamisch Inference Framework: Voor labiele toestanden die gevoelig zijn voor verstoringen door niet-evenwichts afkoeling, ontwikkelden de auteurs een nieuw thermodynamisch raamwerk om de oorspronkelijke evenwichts-populaties te reconstrueren uit de gemeten vitrificeerde ensembles.

Belangrijkste Bijdragen en Resultaten

De studie levert de volgende cruciale inzichten op:

1. Onafhankelijkheid van Water-vitrificatie: De simulaties toonden aan dat de aanwezigheid van het eiwit de vitrificatie van water niet verandert. De overgang van water naar glas verloopt onafhankelijk van het eiwit.
2. Robuustheid van Markov State Model (MSM) Toestanden: Er werd een correlatie gevonden tussen de levensduur van een conformationele toestand en de gevoeligheid voor afkoelingsartefacten. MSM-toestanden met een karakteristieke tijd die langer is dan de duur van het afkoelingsproces, blijken robuust te zijn tegen de verstoringen veroorzaakt door vitrificatie.
3. Behoud van Toestanden: Hoewel sommige toestanden in het evenwichtsensemble bij 230 K zouden verdwijnen (door thermodynamische stabiliteit), bleken deze toestanden niet te verdwijnen in de niet-evenwichts afgekoelde ensembles. Dit suggereert dat vitrificatie toestanden "vastzet" voordat ze kunnen relaxeren naar de lagere-energietoestand van 230 K.
4. Reconstructie van Evenwichtspopulaties: Voor de meer labiele toestanden, waar de afkoeling toch een verstoring veroorzaakt, bleek het ontwikkelde thermodynamische inferentie-framework succesvol om de oorspronkelijke evenwichts-populaties te herstellen uit de verstoorde data.

Significantie

De resultaten van dit paper hebben grote betekenis voor het veld van de structuurbiologie:

• Validatie van Cryo-EM: De studie bevestigt dat cryo-EM een betrouwbare en nauwkeurige biofysische techniek is voor het bestuderen van biomoleculaire ensembles, mits de effecten van afkoeling correct worden begrepen en gecorrigeerd.
• Methodologische Vooruitgang: Het ontwikkelde framework voor het reconstrueren van evenwichts-populaties biedt een oplossing voor het probleem van "bevriezing van niet-evenwichtstoestanden". Dit stelt onderzoekers in staat om meer accurate inzichten te krijgen in de dynamische landschappen van eiwitten, zelfs wanneer deze in een glasachtige toestand worden waargenomen.
• Toekomstige Toepassingen: Door te laten zien dat conformationele diversiteit behouden blijft tijdens vitrificatie (of kan worden hersteld), opent dit de weg voor het gebruik van cryo-EM niet alleen voor statische structuren, maar ook voor het karakteriseren van complexe, dynamische biomoleculaire processen.