LowDoseWizard - rapid and standardised setup of low-dose cryo-TEM imaging in SerialEM

Het artikel introduceert LowDoseWizard, een modulaire en begeleidde workflow binnen SerialEM die de tijd en expertise die nodig zijn om de opstelling van een low-dose cryo-TEM-microscoop te standaardiseren, aanzienlijk reduceert, waardoor snelle configuratie mogelijk wordt die ondersteuning biedt voor hoog-resolutie single-particle datacollectie.

De kern

Stel je voor dat je probeert een perfecte foto te maken van een klein, fragiel sneeuwvlokje met een camera die zo krachtig is dat de flits zelf het sneeuwvlokje zou kunnen smelten. Dit is de dagelijkse uitdaging voor wetenschappers die cryo-TEM (cryo-elektronenmicroscopen) gebruiken om de binnenkant van biologische moleculen te zien. Om een helder beeld te krijgen zonder het monster te vernietigen, moeten ze een extreem "lage dosis" elektronen gebruiken, maar het instellen van de microscoop om dit perfect te doen, is als het stemmen van een vleugelpiano terwijl je ovenwanten draagt – het is moeilijk, tijdrovend en makkelijk om fouten te maken, vooral voor beginners.

Dan is er LowDoseWizard, een nieuwe digitale assistent die is ingebouwd in de besturingssoftware van de microscoop (SerialEM). Denk hierbij aan een GPS-navigatiesysteem voor het instellen van de microscoop.

Hieronder wordt uitgelegd hoe het werkt, met eenvoudige analogieën:

• De "alles-in-één" gids: In plaats dat een gebruiker tientallen complexe knoppen en draaiknoppen handmatig moet aanpassen (zoals de camerainstellingen, de lensfocus en de bundelrichting), hoeft hij of zij slechts een paar basisgegevens in te voeren. LowDoseWizard configureert vervolgens automatisch het volledige "instrumentenpaneel" voor hen.
• De dagelijkse checklist: Net zoals een piloot voor het take-off een voorvluchtchecklist doorloopt, leidt dit hulpmiddel de gebruiker door de essentiële dagelijkse "stembewegingen". Het helpt automatisch de elektronenbundel uit te lijnen en eventuele "astigmatisme" (wat vergelijkbaar is met het corrigeren van een wazige camera-lens) te verhelpen, zodat de microscoop klaar is om foto's te maken.
• De modulaire toolkit: Het systeem is opgebouwd als een set LEGO-blokken. Je kunt de volledige instellingssequentie van begin tot eind uitvoeren, of gewoon één specifiek "blok" (routine) pakken als je alleen een onderdeel van de microscoop wilt repareren. Het is ook flexibel; als je naar een andere microscoop verhuist, hoef je alleen de handleiding (het configuratiebestand) te vervangen zonder het hele hulpmiddel opnieuw te moeten bouwen.

De resultaten:
Toen wetenschappers van het EMBL in Heidelberg deze "GPS" testten, ontdekten ze dat wat voorheen een lange, stressvolle tijd kostte, nu gemiddeld minder dan 15 minuten duurt. Maar snelheid was niet het enige doel; ze moesten weten of de foto's goed genoeg waren.

Ze maakten foto's van een eiwit genaamd apoferritine (een standaard proefpersoon, vergelijkbaar met een "kalibratiedoel" voor camera's) op twee verschillende microscopen. De resultaten waren verbazingwekkend:

• Op een 200 kV-microscoop kregen ze een kristalhelder beeld met een resolutie van 1,62 Angström.
• Op een 300 kV-microscoop behaalden ze een nog scherper 1,09 Angström.

Om dit in perspectief te plaatsen: deze resoluties zijn zo hoog dat de wetenschappers individuele atomen konden zien, wat bewijst dat deze "snelle instelling" geen afbreuk doet aan de kwaliteit.

Waarom dit belangrijk is:
LowDoseWizard fungeert als een universele vertaler tussen de complexe machine en de menselijke gebruiker. Het verlaagt de instapdrempel, wat betekent dat minder ervaren gebruikers of diegenen die het lab slechts af en toe bezoeken, professionele resultaten kunnen behalen zonder urenlang met de bediening te worstelen. Dit is vooral nuttig in gedeelde laboratoria waar veel verschillende mensen dezelfde dure apparatuur gebruiken, zodat iedereen consistente, hoogwaardige data krijgt zonder tijd te verliezen aan routinematige aanpassingen.

Technische samenvatting

Technische Samenvatting: LowDoseWizard

Probleemstelling
De structuuropheldering van biologische macromoleculen via single-particle cryo-elektronmicroscopie (SPA cryo-EM) en cryo-elektrontomografie (cryo-ET) is fundamenteel afhankelijk van opname met lage dosis op cryogene transmissie-elektronmicroscopen (cryo-TEM's). Ondanks het belang ervan blijft de routinematige opstelling van deze microscopen technisch veeleisend en tijdrovend. Deze last is vooral acuut voor onervaren gebruikers of personen die de instrumenten slechts incidenteel gebruiken, waardoor er een drempel ontstaat voor efficiënte dataverzameling.

Methodologie
Om deze uitdagingen aan te pakken, presenteren de auteurs LowDoseWizard, een begeleidde workflow geïmplementeerd binnen de SerialEM-softwareomgeving. Het systeem is ontworpen om een snelle en gestandaardiseerde opstelling van cryo-TEM-opnamecondities mogelijk te maken via de volgende mechanismen:

• Geautomatiseerde Configuratie: Op basis van minimale gebruikersinvoer configureert de workflow automatisch de microscoopoptica, cameraparameters en instellingen voor beeldverschuiving over alle noodzakelijke opnamecondities met lage dosis.
• Begeleide Uitlijning: Het hulpmiddel leidt gebruikers door essentiële dagelijkse uitlijnprocedures, specifiek:
  • Kalibratie van de straalverschuiving (beam shift offset).
  • Correctie van astigmatisme van het objectief.
  • Uitlijning zonder coma (coma-free alignment).
• Modulaire Architectuur: De workflow is georganiseerd in modulaire routines die sequentieel kunnen worden uitgevoerd als een compleet proces of onafhankelijk als zelfstandige taken.
• Aanpasbaarheid aan Instrumenten: Microscoop-specifieke opnameparameters worden gedefinieerd in bewerkbare configuratiebestanden. Dit ontwerp maakt het mogelijk om de kernscripts flexibel aan te passen aan verschillende instrumenten zonder wijzigingen aan de onderliggende code te vereisen.

Belangrijkste Resultaten
De prestaties van LowDoseWizard werden geëvalueerd tijdens gebruikerssessies op drie microscopen bij het EMBL Heidelberg:

• Efficiëntie: Het volledige opstelproces vereiste gemiddeld minder dan 15 minuten.
• Resolutievermogen: Om te verifiëren dat de vooraf gedefinieerde opnamecondities gegenereerd door de workflow compatibel zijn met dataverzameling op hoge resolutie, werden apoferritine-datasets verkregen op twee verschillende instrumenten:
  • Een 200 kV Glacios leverde een reconstructie op met een resolutie van 1,62 Å.
  • Een 300 kV Titan Krios leverde een reconstructie op met een resolutie van 1,09 Å.
    Deze resultaten demonstreren dat de snelle, begeleidde opstelling zowel single-particle cryo-EM op bijna-atomaire als atomaire resolutie ondersteunt.

Betekenis en Aanspraken
Het artikel stelt dat LowDoseWizard de drempel verlaagt voor een robuuste cryo-TEM-opstelling. Door de tijd die wordt besteed aan routinematige parameterselectie en uitlijning te verminderen, stelt het hulpmiddel gebruikers in staat hun inspanningen te richten op specimen-specifieke aspecten van dataverzameling, zoals de selectie van doelen. De auteurs benadrukken de bijzondere waarde van de workflow in omgevingen met gedeelde instrumentatie, waar toegankelijkheid, reproduceerbaarheid en het efficiënt gebruik van microscooptijd cruciale factoren zijn.