Triplet tumbling microscopy enables in situ quantification of protein complex assembly and dynamics

De auteurs ontwikkelden triplet tumbling microscopy (TTM), een veelzijdige beeldvormingstechniek die gebruikmaakt van infrarood-triggerbare triplettoestanden om rotatie-diffusie in levende cellen te meten, waardoor de kwantificatie van assemblage, grootte en dynamiek van proteïnecomplexen in real-time en in situ mogelijk wordt zonder dat voorafgaande kennis van de interagerende partners vereist is.

De kern

Stel je voor dat je probeert te begrijpen hoe mensen in een drukke stad met elkaar omgaan. Meestal moeten wetenschappers mensen uit de stad halen, in een rustige kamer (een lab) zetten en kijken hoe ze elkaar de hand schudden of omhelzen. Maar dit vertelt ons niet precies hoe ze zich gedragen wanneer ze daadwerkelijk rondrennen in de drukke, chaotische straten van een levende cel. Bestaande methoden om deze interacties binnen levende cellen te observeren, lijken op het proberen een handdruk te spotten in een mistig stadion; ze missen vaak de details of vereisen dat je al precies weet wie met wie de hand schudt.

Dit artikel introduceert een nieuw instrument genaamd Triplet Tumbling Microscopy (TTM), dat fungeert als een superkrachtige, hoogwaardige camera die deze interacties in real-time kan zien, direct binnen de levende cel.

Zo werkt het, met een eenvoudige analogie:

De "Spinning Top"-test
Stel je voor dat je een tiny spinning top in een zwembad laat vallen.

• Als de top klein en alleen is, draait en wiebelt hij zeer snel.
• Als je twee tops aan elkaar plakt, worden ze zwaarder en draaien ze langzamer.
• Als je een hele hoop tops aan elkaar plakt tot een gigantisch cluster, wiebelen ze nauwelijks nog; ze drijven gewoon langzaam.

In de wereld van eiwitten (de tiny machines binnen onze cellen) zijn ze voortdurend aan het "tumbling" of draaien terwijl ze rondzweven. De snelheid van deze draaiing vertelt ons hun grootte. Als een eiwit plotseling zijn draaisnelheid vertraagt, betekent dit dat het een partner heeft gegrepen en een complex heeft gevormd.

Het probleem met eerdere camera's
Oude manieren om deze draaiing te meten, waren als het proberen een foto te maken met een camera die een zeer snelle sluitertijd heeft maar een korte batterijduur. Ze konden de draaiing slechts een fractie van een seconde (nanoseconden) observeren. Dit was prima voor tiny, snel-draaiende dingen, maar als het eiwitcomplex groot en traag was, ging de "batterij" van de camera dood voordat de meting kon worden voltooid. Het was als het proberen een langzaam bewegende slak te timen met een stopwatch die alleen werkt voor een knipoog.

De TTM-oplossing
TTM lost dit op door een speciale "infraroodtrigger" te gebruiken die de eiwitten in een unieke energietoestand brengt die een "triplet-toestand" wordt genoemd. Denk hierbij aan het geven van een super-batterij aan de spinning top. Hierdoor kan de microscoop de tumbling veel langer volgen – van een fractie van een seconde tot wel honderden microseconden.

Omdat het zo lang kan kijken, kan TTM alles meten, variërend van:

• Tiny paren: Twee eiwitten die elkaar net ontmoeten (zoals twee mensen die elkaar de hand schudden).
• Medium groepen: Kleine teams van eiwitten die samenwerken.
• Gigantische structuren: Massale clusters ter grootte van hele organellen (zoals een hele wijkblok).

Wat ze daadwerkelijk hebben gedaan
De onderzoekers hebben niet alleen de camera gebouwd; ze hebben hem gebruikt om specifieke interacties in levende cellen te vangen, waarmee ze bewezen dat het werkt. Ze observeerden:

1. Het "samenklik"-moment: Ze gebruikten een chemische stof (rapamycine) om twee eiwitten te dwingen aan elkaar te plakken en keken hoe ze vertraagden toen ze een paar vormden.
2. De "Groepsomhelzing": Ze observeerden het p53-eiwit, dat van nature in groepen verzamelt, en maten hoeveel er op elk moment hand in hand hielden.
3. De "Virale Indringer": Ze keken hoe een menselijk eiwit (E6AP) een eiwit van het Humane Papillomavirus (HPV) greep, en lieten precies zien hoe het virus de machinerie van de cel overneemt.

Waarom dit belangrijk is
Het beste deel is dat je geen gloednieuw, miljoenen-dollar-ruimteschip nodig hebt om dit te gebruiken. De benodigde hardware past in de meeste standaard fluorescentiemicroscopen die laboratoria al hebben. Het is een veelzijdige nieuwe manier om een kijkje te nemen in de complexe, drukke wereld van levende cellen en precies te tellen hoeveel eiwitten samenwerken, zonder ze uit hun natuurlijke omgeving te halen.

Technische samenvatting

Probleem
Proteïne-proteïne-interacties (PPI's) zijn fundamenteel voor uiteenlopende cellulaire processen, maar het karakteriseren ervan binnen levende cellen blijft een aanzienlijke uitdaging. Huidige methoden voor het detecteren van PPI's in vivo zijn vaak beperkt in de reikwijdte van interacties die ze kunnen vastleggen en vereisen doorgaans voorafgaande kennis van de specifieke interagerende partners. Bovendien vertrouwen traditionele benaderingen sterk op gereconstitueerde in vitro biochemische en biofysische technieken, die mogelijk niet de complexiteit van het cellulaire milieu volledig weerspiegelen. Er is een duidelijk behoefte aan een methode die de interacties van een gelabeld eiwit van belang in real-time binnen levende cellen kan onthullen zonder deze beperkingen.

Methodologie
Om deze hiaten aan te pakken, ontwikkelden de auteurs Triplet Tumbling Microscopy (TTM). Deze techniek maakt gebruik van infrarood-triggerbare emissie vanuit triplettoestanden om de rotatiediffusie, of "tumbling", van eiwitten te volgen over tijdschalen variërend van nanoseconden tot honderden microseconden. Door deze langlevende triplettoestanden te meten, rapporteert TTM de grootte van eiwitcomplexen op basis van hun rotatiediffusiesnelheden. De hardware die voor TTM vereist is, is ontworpen om compatibel te zijn met de meeste standaard fluorescentiemicroscopen, wat de adoptie faciliteert voor het extraheren van moleculaire inzichten uit levende cellen.

Belangrijkste bijdragen en resultaten
Het artikel toont aan dat TTM de groottebeperkingen overwint die inherent zijn aan bestaande op rotatiediffusie gebaseerde benaderingen, waardoor het meten mogelijk wordt van soorten variërend van kleine eiwitcomplexen tot organel-grootte parels. In levende cellen pasten de auteurs TTM toe om:

• PPI's te detecteren en het fractie van gebonden eiwitten te kwantificeren.
• Verschillende eiwitcomplexen te onderscheiden op basis van hun grootte.
• Diversiteit aan interactietypen te meten, met name met verwijzing naar:
  • Rapamycine-geïnduceerde dimerisatie.
  • p53 homo-oligomerisatie.
  • De binding van de E3-ligase E6AP aan het humane papillomavirus 16 E6-eiwit.

Betekenis
De auteurs positioneren TTM als een veelzijdig instrument dat het gat kan overbruggen tussen in vitro karakterisering en de complexe context van levende cellen. Door het mogelijk te maken om in real-time de interacties en complexassemblage van een gelabeld eiwit te observeren zonder voorafgaande kennis van alle partners te vereisen, biedt TTM een nieuwe weg voor het kwantificeren van eiwitcomplexdynamiek in situ. De compatibiliteit van de methode met bestaande microscoopinfrastructuur onderstreept het potentieel als een praktische oplossing voor het bestuderen van de dynamiek van proteïne-interacties binnen het native cellulaire milieu.