Combined analysis of chromatin accessibility, promoter interactions and whole genome sequencing solved the missing heritability in gastric cancer

Door chromatin toegankelijkheid, promotorinteracties en whole-genome sequencing te combineren, hebben onderzoekers nieuwe genetische mechanismen ontdekt die de ontbrekende erfelijkheid bij 47% van de families met hereditair diffuse maagkanker verklaren, voornamelijk door deleties van regulatorische elementen die CDH1 en MLH1 beïnvloeden.

De kern

De zoektocht naar de ontbrekende puzzelstukjes in maagkanker

Stel je voor dat het menselijk lichaam een enorme, ingewikkelde fabriek is. In deze fabriek werken duizenden machines (genen) samen om alles soepel te laten lopen. Soms gaat er iets mis in de blauwdruk van deze fabriek, wat leidt tot kanker. Bij een specifieke, erfelijke vorm van maagkanker (HDGC) weten we dat het vaak te maken heeft met een defect in de 'CDH1-machine'. Maar hier zit het probleem: bij veel families met een sterk verhoogd risico op deze kanker, vinden artsen geen fout in die specifieke CDH1-machine. Het is alsof je een auto hebt die niet start, maar de motor (CDH1) ziet er perfect uit.

Waarom start de auto dan toch niet? Waar zit de fout? Dit noemen wetenschappers de "ontbrekende erfelijkheid": we weten dat het erfelijk is, maar we kunnen de oorzaak niet vinden. Tot nu toe.

De nieuwe aanpak: Een drie-in-één detectiveverhaal

In dit onderzoek hebben de wetenschappers een slimme, nieuwe strategie gebruikt om die ontbrekende puzzelstukjes te vinden. Ze hebben niet alleen naar de blauwdruk (het DNA) gekeken, maar ook naar hoe de fabriek is ingericht en hoe de machines met elkaar praten. Ze combineerden drie soorten onderzoek:

1. De blauwdruk (Whole Genome Sequencing): Een volledige scan van alle genen.
2. De fabrieksindeling (Chromatin Accessibility): Hoe is het DNA opgerold? Welke delen zijn makkelijk bereikbaar voor de cellen?
3. De telefoonlijnen (Promoter Interactions): Hoe roepen de schakelaars de machines op?

De ontdekkingen: Verborgen schakelaars en gebrekkige lijnen

Wat vonden ze? Ze ontdekten dat de fouten vaak niet in de machine zelf zaten, maar in de schakelaars of de telefoonlijnen die de machine aansturen.

• Het geval van de verdwenen schakelaars:
  In twee families vonden ze kleine stukjes DNA die ontbraken. Deze stukjes waren geen machines, maar specifieke schakelaars die de CDH1-machine moeten aanzetten.

  • Analogie: Stel je voor dat je een lichtschakelaar hebt die de lamp (CDH1) aan moet doen. In deze families was de schakelkast zelf niet kapot, maar waren de draden naar de schakelaar doorgesneden. Zonder die draden gaat het licht niet aan, ook al werkt de lamp perfect.
  • In één familie ontbrak een stukje DNA dat twee schakelaars bevatte. Zonder deze schakelaars werd de CDH1-machine helemaal niet aangestuurd. In een andere familie was een heel klein stukje (39 letters lang) weg, maar dat was genoeg om de telefoonlijn naar de machine te verstoren.

• Het geval van de verkeerde bestelling:
  Bij een derde familie vonden ze een fout in een ander gen (MLH1), maar dit gen had een speciale schakelaar die specifiek voor de maag was.

  • Analogie: Het is alsof je een fabriek hebt die brood maakt, maar de instructie voor het bakken van brood (de schakelaar) is per ongeluk verwijderd. Omdat de instructie weg is, wordt er geen brood gemaakt, en bovendien raakt de hele fabriek in de war, wat leidt tot een andere vorm van kanker (MSI).

• Het grote geheel: Een verzwakt immuunsysteem
  Bij nog meer families vonden ze niet één, maar meerdere kleine foutjes tegelijk.

  • Analogie: Het is alsof je niet één kapot wiel hebt, maar dat je banden, remmen en vering allemaal een beetje versleten zijn. Samen zorgen deze kleine gebreken ervoor dat de auto (het maagweefsel) niet goed meer kan remmen of verdedigen tegen aanvallen. Ze vonden dat deze foutjes vooral de "mucine" (een soort slijmlaag die de maag beschermt) en het immuunsysteem aantastten. De maag werd zo kwetsbaar dat kanker makkelijker kon ontstaan.

Het resultaat: De puzzel is opgelost

Door deze slimme combinatie van technieken, konden de onderzoekers eindelijk de oorzaak vinden bij 47% van de families die eerder als "raadsel" werden beschouwd.

Wat betekent dit voor de patiënt?
Voor deze families is dit een enorme doorbraak. Vroeger kregen ze geen speciale preventieve maatregelen omdat er geen "bekende" fout was gevonden. Nu weten we dat ze wel degelijk een erfelijke aanleg hebben. Dit betekent dat artsen nu beter kunnen adviseren over preventie en bewaking, wat levens kan redden.

Kortom: Ze hebben niet alleen naar de machines gekeken, maar ook naar de stroomkabels en de schakelaars. En zo vonden ze eindelijk de reden waarom de fabriek in deze families faalt.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Bij erfelijke diffuse maagkanker (HDGC) wordt een aanzienlijk deel van de erfelijkheid gemist ("missing heritability"), geschat op 60% tot 90%. Veel families die voldoen aan de klinische criteria voor HDGC, hebben geen detecteerbare pathogene kiembaanvarianten in de bekende genen CDH1 of CTNNA1. Als gevolg hiervan worden deze individuen niet in aanmerking genomen voor de levensreddende preventieve maatregelen die specifiek zijn gericht op HDGC. Het doel van deze studie was het opsporen van nieuwe predispositiemechanismen die de CDH1-regulerende netwerk beïnvloeden om deze hiaat in de erfelijkheid te verklaren.

Methodologie

De auteurs hanteerden een geïntegreerde aanpak die genoomsequencing combineerde met functionele en epigenetische analyses:

• Genoomsequencing en Variant Calling: Er werden single-nucleotide varianten (SNV's) en copy-number varianten (CNV's) geïdentificeerd uit whole-genome sequencing (WGS) data van 19 probanden uit HDGC-achtige families.
• Epigenetische Profiling: In normaal maagweefsel werden chromatin toegankelijkheid (ATAC-seq), enhancer-markers (ChIP-seq) en interacties van de CDH1-promotor (4C-seq) geanalyseerd om regulatoire elementen (RE's) te lokaliseren.
• Functionele Validatie:
  • In vitro: CRISPR-Cas9-editing, RT-PCR, flowcytometrie en immunohistochemie werden gebruikt in cel lijnen om de causale rol van varianten te testen.
  • In vivo: Enhancer-assays werden uitgevoerd in muizenembryo's.
  • Tumoranalyse: Microsatelliet-instabiliteit (MSI) en eiwitexpressie werden geanalyseerd in tumoren.
• Bio-informatica: Gen-ontologie-analyses en evaluatie van Topologically Associating Domains (TAD's).

Belangrijkste Bijdragen en Resultaten

De studie onthulde drie specifieke mechanismen die de "ontbrekende" erfelijkheid verklaren:

1. Deleties binnen de CDH1-TAD:

   • In families F4 en F9 werden deleties gevonden binnen de topologische associatiedomein (TAD) van CDH1.
   • Familie F4: Een heterozygote 20kb-CNV in het CDH3-gebied bleek twee hypomorfe, weefsel-specifieke regulatoire elementen te bevatten. CRISPR-Cas9-editing toonde aan dat het verlies van deze elementen leidde tot een homozygote vermindering van CDH1 mRNA en eiwit, vergelijkbaar met een coderende deletie. Elk element droeg 50% bij aan de regulatie.
   • Familie F9: Een heterozygote 39bp-intergenische CNV stroomafwaarts van CDH1 veroorzaakte eveneens verlies van CDH1 expressie.

2. Interacties tussen MLH1 en CDH1:

   • Familie F15: Deze familie had een heterozygote 2,7kb kiembaan-CNV in het MLH1-gen die overlapt met een maagspecifiek regulatoir element.
   • De tumor toonde MSI, verlaagde MLH1 expressie en een verlies van CDH1 en E-cadherine eiwitten.
   • CRISPR-Cas9-klonen die deze CNV nabootsten, bevestigden dat het verlies van dit regulatoire element leidde tot een cascade van verlaagde expressie van zowel MLH1 als CDH1, wat een nieuw mechanisme voor bijkomende tumorontwikkeling suggereert.

3. Oligogene Patroon en Immuunfenotype:

   • Bij zes aanvullende families, met name bij jongere patiënten, werden meerdere deleties gevonden in maag-specifieke toegankelijke chromatinsequenties buiten de CDH1-TAD.
   • Deze deleties troffen specifiek mucine-genen en immuun-gerelateerde pathways, wat leidt tot een immuun-gecompromitteerd fenotype in de maag.

Significantie

Deze studie heeft een doorbraak bereikt in het oplossen van het probleem van de ontbrekende erfelijkheid bij HDGC:

• Oplossing van het hiaat: Door de combinatie van maagspecifieke chromatin toegankelijkheid, promotor-interacties en whole-genome sequencing, konden de auteurs de genetische oorzaak vinden in 47% van de HDGC-achtige families binnen de cohort.
• Nieuwe Mechanismen: Het paper identificeert dat niet alleen coderende mutaties, maar ook deleties van niet-coderende, weefsel-specifieke regulatoire elementen (zowel binnen als buiten de CDH1-locus) een cruciale rol spelen.
• Klinische Impact: Deze bevindingen hebben directe gevolgen voor de klinische praktijk. Patiënten met deze varianten, die voorheen als "onverklaarbaar" werden beschouwd, kunnen nu worden geïdentificeerd en in aanmerking komen voor de noodzakelijke preventieve maatregelen (zoals prophylactische gastrectomie), wat levens kan redden.