Two-photon characterisation of long-Stokes-shift dye ATTO 490LS for single-laser multicolour imaging

Este estudo caracteriza as propriedades de excitação de dois fótons do corante ATTO 490LS, demonstrando sua eficácia para imageamento multicolorido com um único laser em microscopia de dois fótons.

O essencial

🌟 A Magia da "Luz de Longa Distância" no Cérebro de Moscas

Imagine que você é um detetive tentando observar a vida secreta dentro do cérebro de uma pequena mosca da fruta (Drosophila). Para ver os detalhes, você precisa de uma lanterna muito especial (um laser) e de óculos de visão noturna (câmeras sensíveis). O problema é que, na maioria dos laboratórios, você só tem uma lanterna (um laser de cor única) para iluminar tudo.

Se você quiser ver duas coisas diferentes ao mesmo tempo (por exemplo, neurônios verdes e estruturas vermelhas), a lanterna única costuma causar confusão: as cores se misturam, como tentar ouvir duas músicas diferentes tocando no mesmo volume e na mesma frequência.

O que os cientistas descobriram?
Eles encontraram uma "pílula mágica" de corante chamada ATTO 490LS que resolve esse problema de forma brilhante.

1. O Problema: A Lanterna Única

Normalmente, para ver duas cores diferentes, você precisaria de duas lanternas (lasers) diferentes. Mas muitos microscópios antigos ou mais baratos só têm uma. É como tentar pintar um quadro com apenas um pincel e uma cor de tinta, mas tentando criar um arco-íris.

2. A Solução: O "Pulo do Gato" (Desvio Longo)

O corante ATTO 490LS tem um superpoder chamado Desvio de Stokes Longo.

• Como funciona: Imagine que você joga uma bola de tênis (a luz do laser) contra uma parede.
  • Corantes normais: A bola quica de volta quase na mesma velocidade e altura. É difícil distinguir a bola que você jogou da bola que voltou.
  • O ATTO 490LS: A parede é mágica! Quando a bola (luz azul/verde) bate nela, ela perde muita energia e volta como uma bola de tênis lenta e pesada (luz vermelha).
• O resultado: A luz que entra e a luz que sai são tão diferentes que o microscópio consegue separá-las perfeitamente, mesmo usando a mesma lanterna.

3. O Experimento: A Dança das Cores

Os cientistas testaram esse corante no cérebro de moscas geneticamente modificadas. Eles usaram:

• Uma única lanterna laser (na cor verde-azulada, 920 nm).
• Duas câmeras: Uma que só vê verde e outra que só vê vermelho.

O que aconteceu?

• Eles pintaram o cérebro com o ATTO 490LS (que brilha em vermelho).
• Eles também usaram um corante comum (Alexa Fluor 488) que brilha em verde.
• Ao ligar a única lanterna, o microscópio conseguiu ver as duas cores separadas!
  • A câmera verde viu apenas o corante verde.
  • A câmera vermelha viu apenas o ATTO 490LS (mesmo sendo excitado pela mesma luz verde).

É como se você estivesse em uma festa com uma única luz branca, mas conseguisse ver os convidados usando óculos escuros que filtram apenas as roupas vermelhas e outros que filtram apenas as roupas verdes, sem que as cores se misturassem.

4. Por que isso é importante?

• Economia e Simplicidade: Laboratórios que têm microscópios antigos (com apenas um laser) agora podem fazer imagens complexas e coloridas sem precisar comprar equipamentos caríssimos novos.
• Ciência Mais Clara: Isso permite que os cientistas vejam a estrutura do cérebro (em vermelho) e a atividade dos neurônios (em verde, usando sensores como GCaMP) ao mesmo tempo. É como assistir a um filme onde você vê tanto o cenário quanto a ação dos atores simultaneamente.

Em Resumo

Os cientistas provaram que o corante ATTO 490LS é um "truque de mágica" óptico. Ele permite que uma única lanterna ilumine duas cores diferentes no cérebro de uma mosca, transformando equipamentos simples em ferramentas poderosas para desvendar os segredos do cérebro. É uma vitória para a ciência acessível e para a nossa compreensão de como os neurônios se comunicam! 🧠✨🔦

Resumo técnico

Título: Caracterização de dois fótons do corante ATTO 490LS para imagem multicolorida de laser único em microscopia de dois fótons (2P)

1. O Problema

A microscopia de dois fótons (2P) é uma ferramenta essencial para a imagem profunda de tecidos, como o cérebro de Drosophila melanogaster. No entanto, muitos sistemas de microscopia de dois fótons, especialmente modelos mais antigos ou de custo reduzido, possuem apenas um laser de excitação fixo (geralmente 920 nm).

• Desafio: Realizar imageamento multicolorido (duplexado) com um único laser é difícil porque a maioria dos fluoróforos comuns (como a GFP e seus derivados, GCaMP) e muitos corantes sintéticos compartilham perfis de excitação semelhantes, mas emitem em comprimentos de onda que podem sobrepor-se ou não ser distinguíveis com filtros padrão sob uma única excitação.
• Oportunidade: Fluoróforos com Desvio de Stokes Longo (LSS - Long-Stokes-Shift) são excitados em um comprimento de onda curto, mas emitem em um comprimento de onda muito mais longo. Isso reduz a sobreposição entre excitação e emissão e minimiza o ruído de autofluorescência. O corante ATTO 490LS possui um desvio de Stokes de 165 nm sob excitação de um fóton (excitação em 496 nm, emissão em 661 nm), mas suas propriedades de dois fótons não haviam sido caracterizadas, limitando sua aplicação em sistemas de laser único para imageamento de estruturas neurais.

2. Metodologia

Os autores realizaram uma caracterização espectral completa do ATTO 490LS e validaram sua utilidade em imagens de cérebros de moscas ex vivo.

• Preparação da Amostra: Foram utilizados cérebros de Drosophila com o genótipo elav-Gal4>UAS-TID-Dlg1. O sistema de proximity labeling (BioID) foi usado para biotinilar proteínas próximas ao marcador neuronal Dlg1.
• Marcação:
  • Vermelho: Corante ATTO 490LS conjugado à estreptavidina (liga-se à biotina).
  • Verde: Anticorpo anti-c-Myc (marcando o tag Myc no Dlg1) seguido por um secundário Alexa Fluor 488.
• Análise Espectral (Microscópio Leica TCS SP8 DIVE):
  • Varredura de Excitação: Variação do comprimento de onda de excitação de 680 nm a 1200 nm para identificar os picos de excitação de dois fótons.
  • Varredura de Emissão: Fixação da excitação em comprimentos de onda específicos (780, 920, 940 e 1040 nm) e variação da detecção de emissão de 500 nm a 780 nm.
• Imageamento Duplexado (Microscópios Thorlabs):
  • Utilização de microscópios equipados com laser de fibra fixo de 920 nm.
  • Detecção simultânea em dois canais: Canal Verde (PMT com filtro 525/50 nm) para Alexa Fluor 488 e Canal Vermelho (PMT com filtro 605/70 nm) para ATTO 490LS.
  • Comparação de diferentes potências de laser e ganhos de detector.

3. Principais Contribuições

• Caracterização Inédita: Primeira descrição das propriedades de excitação e emissão de dois fótons do ATTO 490LS.
• Validação para Laser Único: Demonstração de que o ATTO 490LS pode ser excitado eficientemente por lasers de 920 nm (comum em sistemas de imagem de Drosophila), permitindo a combinação com fluoróforos verdes (como GCaMP ou Alexa 488) sem necessidade de lasers adicionais (ex: 960 nm ou 1040 nm).
• Ferramenta de Imageamento Estrutural: Estabelecimento do ATTO 490LS como um marcador estrutural vermelho estável para uso simultâneo com sensores funcionais verdes.

4. Resultados

• Espectro de Excitação: O ATTO 490LS apresentou três picos de excitação de dois fótons:
  1. 780 nm: Pico de máxima eficiência (intensidade normalizada de 79,1).
  2. 940 nm: Segundo pico local (intensidade de 11,1).
  3. 1040 nm: Terceiro pico (intensidade de 10,7).
  • Nota: Embora o pico global seja em 780 nm, a excitação em 920-940 nm é viável e preferível para reduzir a autofluorescência do tecido.
• Espectro de Emissão: Sob excitação em 920 nm, 940 nm e 1040 nm, o corante emite consistentemente com um pico em 640 nm.
• Imageamento Duplexado:
  • Foi possível obter imagens claras e distintas de ambos os canais (Vermelho e Verde) simultaneamente usando apenas um laser de 920 nm.
  • Especificidade: Estruturas como o corpo elipsoidal foram marcadas apenas pelo ATTO 490LS, enquanto os lóbulos γ do corpo em cogumelo foram marcados apenas pelo Alexa 488. Outras estruturas (lóbulos α/β e lóbulos antenais) mostraram marcação dupla, confirmando a sobreposição espacial e a distinção espectral.
  • A sinalização do ATTO 490LS foi detectável mesmo com ganhos baixos no PMT vermelho (1%), enquanto o canal verde exigiu ganhos mais altos (5-30%), demonstrando a alta sensibilidade do sistema.

5. Significado e Impacto

• Acesso Democratizado: Esta descoberta remove barreiras técnicas para laboratórios que possuem apenas um laser de 920 nm, permitindo imageamento multicolorido de alta qualidade sem a necessidade de equipamentos caros com lasers sintonizáveis ou múltiplos lasers.
• Integração Funcional-Estrutural: Permite o imageamento simultâneo de transientes de cálcio (usando GCaMP verde) e marcadores estruturais estáveis (ATTO 490LS vermelho) em animais vivos ou ex vivo. Isso é crucial para correlacionar a atividade neuronal com a morfologia em circuitos neurais complexos.
• Futuro: Os autores planejam desenvolver conjugados de ATTO 490LS para tags genéticos (HaloTag, SNAP-tag), expandindo o toolkit para imageamento quimiogenético em Drosophila e outros modelos, facilitando a análise de circuitos neurais em animais comportando-se.

Em resumo, o trabalho valida o ATTO 490LS como uma ferramenta robusta e acessível para microscopia de dois fótons multicolorida, otimizando o uso de equipamentos de laser único na neurociência.