Measuring Nanoscale Torques with Cylindrical-Polarization-based Interferometric Scattering Microscopy

技术摘要：基于柱面偏振的干涉散射显微成像技术 (cypiSCAT) 测量纳米级扭矩

问题陈述
理解纳米级系统（特别是分子马达和合成纳米机器的旋转动力学）需要能够在液体环境中测量单分子水平的扭矩。目前的光学方法面临着光学可检测性与流体动力学响应性之间的根本权衡。为了获得用于快速读取的高信噪比 (SNR)，研究人员通常采用大型标签（例如大型荧光分子或散射纳米颗粒）。然而，增加标签尺寸会显著增加旋转阻力 ($\gamma_{rot} \propto L^3$)，从而抑制系统的响应性，并使快速的扭矩驱动动力学被热涨落所掩盖。相反，对扰动极小的低阻力探针往往太暗，无法在解析快速旋转事件及将其与热噪声区分开所需的微秒级时间尺度内被检测到。现有的高速技术（如暗场显微术或单荧光分子各向异性测量）要么缺乏必要的时间分辨率（通常限制在每秒数百帧），要么存在运动模糊或光子通量不足的问题，导致无法实现亚度级的角定位精度。

方法论：cypiSCAT
作者引入了基于柱面偏振的干涉散射显微成像技术 (cypiSCAT)，该技术旨在将各向异性散射体的取向直接编码到单个干涉点扩散函数 (PSF) 中，同时本质上抑制各向同性背景。

• 光学原理： 该系统利用宽场 iSCAT 显微镜，并在后焦面（与图像面共轭）放置了一个定制的复合涡旋半波片。该元件由一个具有连续旋转快轴（拓扑电荷 $m=1$）的液晶聚合物 (LCP) 层和一个中心无双折射性的各向同性圆盘组成。
• 干涉机制： 当亚波长物体散射光线时，散射波通过涡旋板变成柱面矢量光束。参考波（通过中心各向同性圆盘传输）保持均匀偏振。
  • 各向同性散射： 对于各向同性散射体，散射波与参考波具有正交的圆偏振特性，因此不发生干涉，产生一个没有取向信息的甜甜圈状强度分布。
  • 各向异性散射： 对于各向异性散射体（如金纳米棒），对称性被打破。部分散射光与参考波发生相长干涉，而另一部分则发生相消干涉。这产生了一个偶极型 PSF，其取向与散射体的取向直接相关。
• 信号提取： 在弱散射条件下（$s \ll r$），各向异性相关的干涉项（$I_{int} \propto r \cdot s_{aniso}$）主导于各向同性散射项（$I_{scat} \propto s^2$），这使得即使在微弱各向异性的情况下也能检测到取向，因为各向同性背景被有效抑制。

核心贡献与实验设置

• 硬件实现： 作者通过蚀刻商业 LCP 涡旋延迟器中心区域，制造了一个复合涡旋半波片。他们将该元件集成到工作波长为 660 nm 的透射式 iSCAT 显微镜中，并配备了能够达到 300,000 帧/秒 (fps) 的高速相机。
• 探针： 研究采用了由金纳米棒 (GNRs, 25 nm $\times$ 71 nm) 连接至十字形 DNA 折纸结构组成的低阻力取向标签。这些标签通过旋转不受限的连接子锚定在玻璃表面，以允许自由的扩散旋转。
• 校准与扭矩施加： 为了验证扭矩测量，作者施加了一个次级的、聚焦的圆偏振激光束 (640 nm) 来诱导金纳米棒产生光学扭矩，从而对系统的扭矩灵敏度进行校准。

结果

• 静态取向精度： 利用图案化金纳米棒在硅片上的实验，该系统展示了确定绝对取向的高精度能力。测得的按 45 度增量设计的纳米棒之间的相对旋转为 $45 \pm 6$ 度，这主要受限于制造精度。
• 背景抑制： 使用金纳米球（直径 60 nm）的实验证实，与标准圆偏振 iSCAT 相比，cypiSCAT 将各向同性散射体的对比度降低了约 6 倍，验证了其内在的背景抑制能力。
• 动态追踪： 系统以 300,000 fps 的速度追踪了系留 DNA-GNR 标签的扩散旋转。这种微秒级的时间分辨率实现了角度轨迹的无歧义展开，避免了在较低速度追踪中常见的 $2\pi$ 歧义问题。
• 旋转微流变学： 通过测量系留标签在不同甘油浓度（0%、20%、50%）缓冲液中的旋转扩散系数 ($D_{rot}$)，作者证明了该方法能够准确报告局部流体动力学参数。测得的 $D_{rot}$ 值遵循理论上的 $D_{rot} \propto 1/\eta$ 依赖关系，尽管实验值略高于理论预测（归因于表面电荷效应）。
• 扭矩计量： 该系统实现了静态物体亚度级以及动态追踪约两度的角定位精度。通过施加光学诱导扭矩，作者展示了探测低至 ~1 pN nm 扭矩的能力。在标准成像条件下的基线测量显示，诱导扭矩低于 0.3 pN nm，证实了测量过程本身不会显著扰动热动力学。

意义与主张
论文声称 cypiSCAT 建立了直接进行单分子水平扭矩计量的新测量范式。通过结合超快时间分辨率（微秒级）、长时间观察以及低阻力探针，该方法克服了传统的可检测性与流体动力学响应性之间的权衡。

作者断言，这种能力可以实现对纳米级旋转动力学的定量表征，并提取低至 ~1 pN nm 的光学诱导扭矩。他们将 cypiSCAT 定位为捕捉生物分子系统中快速且罕见旋转事件的有力工具，例如 RNA 聚合酶或 $F_1$-ATPase 的运行，在这些系统中，微妙的扭矩和快速的动力学过程此前难以被直接解析。此外，他们指出，该技术对弱各向异性的敏感性最终可以扩展到无标签的各向异性生物分子复合物的取向成像。