GPSNorm: Gaussian Process Spatial Normalization for Spatial Transcriptomics

GPSNorm 技术摘要：用于空间转录组学的高斯过程空间归一化

问题陈述

空间转录组学（ST）技术（如 10x Genomics Visium 和 NanoString GeoMx）能够在保留组织结构的同时实现全基因组水平的基因表达测量。然而，ST 数据深受技术变异性的影响，包括文库大小差异、切片级批次效应以及空间伪影（如染色变化或组织厚度）。与批量测序（bulk RNA-seq）或单细胞 RNA 测序不同，ST 中的这些技术成分通常具有空间结构性，这使得它们很难与具有生物学意义的空间信号区分开来。

目前的归一化方法通常将归一化视为一个顺序的前处理步骤：计数通过全局或具有空间信息的缩放因子进行调整，随后在这些调整后的固定值上进行下游分析（如差异表达分析）。这种两阶段工作流忽略了归一化过程中引入的不确定性。当技术成分和生物成分在空间上部分可分离时，将归一化值视为固定值会导致下游统计分析中的效应量估计出现偏差，并导致推断过于保守（anti-conservative）。

方法论：GPSNorm 框架

作者提出了 GPSNorm（高斯过程空间归一化），这是一个贝叶斯层次模型框架，旨在统一模型中同时估计技术变异、空间结构和生物信号。

1. 层次模型规范：

• 数据模型： 基因 $g$ 在空间单元 $i$ 的观测转录计数 $y_{gi}$ 使用带有对数连接函数的负二项分布进行建模。
• 线性预测器： 对数均值被分解为：
  • 偏移量（Offset）： 已知的文库大小/测序深度（$L_i$）。
  • 生物效应： 基因特异性基线（$\alpha_g$）以及感兴趣协变量（如疾病状态）的回归系数（$\beta_g$）。
  • 技术效应： 切片级效应（$\gamma_s$）和切片特异性空间效应（$f_{i,s}$）。
• 控制基因： 模型利用负对照基因（NEG）和管家基因（HK）。对于负对照基因，其基因特异性生物参数被约束为零，从而允许这些特征在没有生物信号干扰的情况下，锚定共享技术变异和离散度的估计。

2. 空间建模：

• 每个切片内的空间依赖性使用**内在条件自回归（ICAR）**先验进行建模。这作为平滑高斯过程的一种稀疏离散近似（通过随机偏微分方程链接）。
• 空间场由**高斯马尔可夫随机场（GMRF）**表示，该场由源自空间单元邻域结构的图拉普拉斯矩阵定义。与稠密高斯过程协方差矩阵相比，这确保了计算的可扩展性。

3. 推断：

• 该模型属于潜在高斯模型（LGMs）类别。
• 使用**集成嵌套拉普拉斯近似（INLA）**进行高效的近似贝叶斯推断。INLA 通过利用 ICAR 先验的稀疏精度矩阵结构并对超参数进行确定性积分，避免了马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）的高昂计算成本。
• 不确定性传播： 与两阶段方法不同，GPSNorm 在估计差异表达参数（$\beta$）时，会对潜在归一化成分（$u$）的不确定性进行积分。当归一化与生物信号发生混淆时，这会产生更宽、更校准的置信区间。

4. 归一化输出：
该框架提供了两种将后验估计投影回计数规模的方法：

• 后验中位数投影（Posterior-Median Projection）： 使用线性预测器的生物成分计算负二项分布的中位数。
• 百分位数调整计数（Percentile-Adjusted Counts, PAC）： 转换观测计数以保留秩（rank）和离散度，同时调整均值结构以消除技术效应。

核心贡献

1. 联合建模： GPSNorm 将归一化从一个预处理步骤重新定义为一个在层次贝叶斯框架内的联合估计问题，明确地将归一化不确定性传播到下游推断中。
2. 空间技术建模： 它引入了切片特异性的 ICAR 先验，以捕捉经常与生物梯度相混淆的平滑、具有空间结构的技术伪影。
3. 可扩展性： 通过利用 INLA 和 GMRF 的稀疏结构，该方法能够对大型空间图进行高效推断，而不会产生与稠密高斯过程求逆相关的立方复杂度。
4. 控制集成： 该框架正式整合了负对照基因和管家基因，以锚定技术变异的估计，减少了技术成分与生物成分之间的混淆。

结果

作者通过基于经验数据分布的模拟研究以及在三个真实世界数据集上的应用评估了 GPSNorm。

1. 模拟研究：

• 技术恢复： 即使在强生物学混淆（差异表达与空间信号之间存在 70% 重叠）的情况下，GPSNorm 也能准确恢复模拟的空间技术场（相关性 > 0.92）。
• 差异表达（DE）性能： 与现有方法（如 scran, Giotto, SpaNorm, sct）相比，GPSNorm 表现出：
  • 在对数倍数变化（log-fold change）估计方面偏差极小。
  • 降低了均方根误差（RMSE）。
  • 提高了差异表达基因的排序性能（AUC），尤其是在具有高技术复杂性的场景下。
• 不确定性校准： 在真实的 DE 效应为零的简化模拟中，联合估计在强空间混淆下仍能保持名义 95% 置信区间覆盖率，而两阶段方法产生的区间则过于乐观（覆盖率趋于 0%）。

2. 真实数据应用：

• 10x Visium 人类 DLPFC 数据集： GPSNorm 成功恢复了预期中寡突胶质细胞标记物 MOBP 在白质区域的富集模式，这一模式在原始数据中被文库大小的异质性所掩盖，并在非空间方法中被部分遗漏。它还为这些空间模式提供了后验不确定性估计。
• NanoString GeoMx COVID-19 肺损伤数据： 在一个小型样本研究（46 个 AOI）中，GPSNorm 识别出了与严重损伤相关的生物相关趋化因子（CCL18, CXCL10, CCL2）以及与轻度损伤相关的 SCGB1A1。其他方法未能识别出显著基因，这可能是由于无法在小队列中传播归一化不确定性。
• GeoMx 空间器官肾脏图谱： GPSNorm 在保留用于肾小球和近端小管解剖区域的预期转录对比方面，表现优于其他方法，维持了对精选标记基因的高优先级识别。

3. 计算扩展性：
作者证明，在模型拟合前将感兴趣区域（AOI）聚类为簇，可以显著缩短运行时间（高达 5 倍加速），同时保留高信号基因的排序和效应量大小。

意义与主张

论文声称，将归一化视为潜在统计推断问题而非确定性的预处理步骤，可以显著提高空间转录组学分析的鲁棒性和可解释性。

• 鲁棒性： 通过对技术效应和生物效应进行联合建模，GPSNorm 降低了在归一化过程中吸收生物学意义变异的风险，并防止了在下游差异表达分析中低估不确定性。
• 可解释性： 该框架允许研究人员量化空间表达表面的不确定性以及归一化调整，从而为实验变异提供更完整的图景。
• 适用性： 该方法特别适用于技术空间结构与生物空间结构相互交织，或者样本量较小（如针对性的空间平台如 GeoMx）的情景，因为其层次结构允许在基因和空间单元之间共享信息。

作者指出了局限性，包括对于极大数据集的计算成本（通过 AOI 聚类得到缓解）以及对技术效应采用平滑空间先验的假设。他们建议未来的工作可以扩展该框架，以联合建模空间变异基因检测并整合单细胞参考数据。