nf-cavalier: A Nextflow Pipeline for Rare Disease Variant Prioritization and Reporting

技术摘要：nf-cavalier：用于罕见病变异优先级排序与报告的 Nextflow 流水线

问题陈述
从基因组测序数据中识别候选致病遗传变异是一个复杂的多步骤过程，需要协调多种软件工具和数据源。研究人员必须针对已知的疾病关联（如 PanelApp、HPO）、基因模型（GENCODE）、致病性预测（如 CADD）、群体频率（如 gnomAD）以及临床数据库（如 ClinVar）来解读数百万个变异调用。这一任务还因需要对短变异（SNVs 和 indels）与结构变异（SVs）进行联合解读而变得更加复杂，因为这两者通常在独立的流程中处理。现有的工具往往仅解决该工作流中的特定方面：VEP 处理注释但缺乏遗传模式过滤；slivar 支持遗传查询但缺乏注释和可视化功能；而像 igv-reports 或 SVPV 之类的工具提供可视化功能却不进行优先级排序。因此，需要一个统一的框架来编排这些任务，以提高可重复性和易用性，特别是在由于缺乏持久性服务器基础设施（如 seqr 或 Scout 所需）而受限的机构高性能计算（HPC）环境中。

方法论
nf-cavalier 是一个旨在自动化基因组变异注释、过滤和报告的 Nextflow 流水线。它基于 VCF 规范构建，以确保与各种上游调用器的兼容性，并进行了容器化处理，以便在本地机器、HPC 集群和云环境中实现可移植性。该流水线由三个主要模块组成：

1. 注释： 流水线接收队列 VCF（包含短变异和/或结构变异），将其拆分为分片进行并行处理，并进行标准化。它利用了标准工具，包括 bcftools、vcfanno、VEP 和 SVAFotate。

   • vcfanno 能够快速整合预计算的指标，如 gnomAD v4.1 群体频率、ClinVar 致病性分类和 CADD 分数。
   • VEP 添加基因层面的后果预测和转录本依赖性注释（例如 REVEL、AlphaMissense、SpliceAI）。
   • SVAFotate 通过基于重叠的匹配方法转移 gnomAD v4.1 的 SV 频率。
   • 一个设置流水线负责自动下载所需的参考数据集，并提供基于 1000 Genomes CEPH 三联体的演示数据集。

2. 质量控制 (QC)： 一个专门的 QC 工作流运行 somalier 和 SCE-VCF，以评估样本亲缘关系、性别一致性、遗传祖先和污染情况，允许用户验证家系关系并识别问题样本。

3. 过滤与报告：

   • 过滤： 基于家系进行操作，使用用户可配置的参数。过滤器包括基因列表（PanelApp、HPO、基因组区域、自定义列表）、基因内后果以及有害性预测。流水线应用遗传模型（显性、隐性、复合杂合）和等位基因频率阈值（显性默认为 1/10,000，隐性默认为 1/100）。保留目标基因中 ClinVar 致病/可能致病的变异，同时排除良性变异。
   • 报告： 使用 igv-reports、SVPV 或 Samplot 对候选变异进行可视化，以支持人工审查。结果被编译成交互式静态 HTML 报告和 PowerPoint 幻灯片集。HTML 报告包含指向外部资源（PanelApp、HPO、ClinVar、gnomAD、UCSC）的嵌入式链接，并允许交互式查询。关于基因列表和运行参数的元数据被嵌入其中，以确保审计性和可重复性。

核心贡献

• 统一的工作流： nf-cavalier 将注释、基于遗传模式的过滤、可视化和报告集成到一个单一且可重复的 Nextflow 流水线中，解决了目前零散的即时处理方法带来的问题。
• 基础设施无关性： 与依赖服务器的工具（如 seqr 或 Scout）不同，nf-cavalier 及其最接近的对比工具 MOLGENIS-VIP 在运行时不需要实时服务器或数据库后端。这使其适用于 Kubernetes 或 Docker 部署受到限制的机构级 HPC 环境。
• 灵活的优先级排序： 该流水线并不强制执行自动化的 ACMG 分类，而是将过滤标准（如等位基因频率、基因型质量、后果类别）作为独立可配置的命名参数公开。这允许研究人员透明地检查、理解并迭代优化其过滤策略。
• 可扩展性： 通过对 VCF 进行分片处理以实现并行计算，流水线根据可用计算资源将运行时间从数天缩短至数小时。
• 输出多样性： 流水线生成用户友好的输出，包括具有交互功能的静态 HTML 报告和带有嵌入式可视化的 PowerPoint 幻灯片，从而促进临床研究团队的快速审查。

结果与应用
该流水线已在过去五年的多个大规模研究中得到应用，证明了其在真实研究环境中的效用：

• Austin Health 成年未诊断疾病项目 (AHA-UDP)： 为 16/50 (32%) 的参与家系提供了诊断支持。
• 发育性和癫痫性脑病 (DEE) 队列： 用于识别 37/242 (15%) 的参与者中的分子原因，包括检测到 9 个结构变异和一个位于 FBRSL1 的复杂 SV。
• FGF14 发现： 通过帮助排除其他致病解释，协助发现了作为晚发性小脑性共济失调常见原因的 FGF14 内含子重复扩增。
• RFC1 发现： 前身 CAVALIER R 包辅助发现了导致 CANVAS 综合征的 RFC1 重复扩增。

意义
本文将 nf-cavalier 定位为一种专门为探索性、可调优的研究候选发现而设计的工具，而非严格面向生产的诊断分类工具。其意义在于能够降低罕见病变异优先级排序的准入门槛，通过减少手动工作量和提高可重复性，且无需承担基于服务器的解决方案所带来的基础设施开销。通过提供一个透明、可配置且兼容短变异与结构变异的框架，它使临床研究团队能够高效地应对基因组数据的复杂性，从而识别候选变异以进行下游验证。该工具是开源的（MIT 许可证）并在 GitHub 上维护，确保了研究社区的可访问性。