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Defining the role of aerobic respiration in the metabolism and bioenergetics of Enterococcus faecalis

这项研究表明，在粪肠球菌（*Enterococcus faecalis*）中，胞质内 NADH 氧化酶（Nox）是氧气的主要消耗者以及氧化还原和能量稳态的关键调节因子，而 F 型 ATP 合成酶则是质子动力势的主要产生者，其中电子传递链与 Nox 在该细菌的有氧生物能量代谢中发挥着互补作用。

原作者： Paxie, O., Nijagal, B., Todd Rose, F. O., Gastrell, S., Su, S., Saleh, A., Grimshaw, J. W., Rhee, K., Strahl, H., Cook, G. M., Darnell, R. L.

发布于 2026-08-31

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CC BY 4.0

原作者： Paxie, O., Nijagal, B., Todd Rose, F. O., Gastrell, S., Su, S., Saleh, A., Grimshaw, J. W., Rhee, K., Strahl, H., Cook, G. M., Darnell, R. L.

原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 ⚕️ 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。阅读完整免责声明

细菌通常被认为是非常简单的生物，要么像我们一样呼吸，要么像酵母菌那样发酵食物。但许多细菌，包括一种被称为“粪肠球菌”（Enterococcus faecalis）的常见肠道居民，其适应能力要强得多。它们是兼性厌氧菌，这意味着它们在有氧或无氧环境下都能生存。当氧气存在时，许多细菌会启动一套复杂的系统，称为电子传递链，以高效地产生能量，就像一台高性能发动机一样。这个过程通常涉及将电子传递通过一系列蛋白质，从而产生一种驱动生产ATP（细胞的通用燃料分子）的力量。然而，粪肠球菌是一种机会性病原体，在人类肠道中茁壮成长，而肠道是一个氧气水平剧烈波动的环境。几十年来，科学家们一直假设，如果这种细菌能够接触到氧气，它就会利用其呼吸机制来提高能量并加速生长。问题在于：这种细菌实际上是利用其呼吸工具来产生更多能量，还是将其用于完全不同的用途？

一个研究小组致力于通过构建一张详细的地图来回答这个问题，以此了解粪肠球菌如何处理氧气。他们专注于该细菌应对氧气的两种特定工具：一个是名为细胞色素 bd 氧化酶的膜结合机器，它是传统呼吸链的一部分；另一个是名为 NADH 氧化酶的胞质酶，它的作用更像是一个简单的氧气清除器。为了观察每种工具的具体作用，科学家们创建了精确的基因突变体。他们分别或组合式地移除了呼吸链、清除酶以及制造 ATP 的机器相关的基因。随后，他们在受控环境中培养这些改良后的细菌，有些环境氧气充足，有些则氧气极少，并密切观察细菌对氧气的消耗量、生长速度以及其内部能量水平的变化情况。

结果推翻了标准的预期。当研究人员测量细菌消耗氧气的量时，他们发现胞质清除酶才是主要的驱动力，其吞噬氧气的速率远高于呼吸链。事实上，当移除清除酶时，氧气消耗量大幅下降，但移除呼吸链对氧气使用量几乎没有影响。这表明，该细菌在有氧环境下的主要目标不是运行一个高效率的能量工厂，而仅仅是清除其环境中的氧气。研究人员还观察了细菌的生长情况，并发现了一个令人惊讶的转折：在富氧条件下，缺乏呼吸链的突变体生长速度实际上比正常细菌略快。这表明，运行呼吸链实际上可能会减慢细菌的速度，可能是因为运行该链具有能量成本，或者因为它干扰了细菌首选的通过发酵产生能量的方式。

为了理解为什么会发生这种情况，研究小组分析了细胞内的化学构建模块。他们发现，当缺少清除酶时，细菌难以维持其内部燃料分子的正确平衡。其能量货币与其消耗形式的比率发生了偏移，且碳在代谢途径中的流动也受到了阻碍。这证实了清除酶对于保持细菌内部化学反应顺畅运行至关重要，使其即使在有氧的情况下也能继续快速发酵食物。相比之下，呼吸链在维持这种化学平衡方面似乎起到的作用很小，仅作为一个备份系统，在许多情况下可以被细菌忽略。

关于该细菌如何维持其内部电荷（这是细胞生存的关键因素）的发现或许是最令人意想不到的。在大多数细菌中，呼吸链通过向细胞膜两侧泵送质子来产生这种电荷，进而驱动 ATP 制造机器。然而，在粪肠球菌中，研究人员发现呼吸链并不是这种能量的主要来源。相反，ATP 制造机器本身似乎在反向运行。它利用存储在 ATP 中的能量向细胞外泵出质子，从而产生必要的电荷。这是一种罕见的策略，本质上是利用细胞自身的燃料来为自己的电池供电。呼吸链和清除酶仅间接地参与这一过程，即确保细胞拥有足够的燃料和清洁的化学环境，使 ATP 机器能够正常工作。

这些发现描绘了一幅细菌优先考虑速度和化学平衡而非最大能量效率的图景。粪肠球菌似乎并不关心在有氧时从食物中提取每一单位的能量。相反，它主要将氧气作为一种工具，用来重置其内部的化学平衡，从而使其能够持续快速地发酵食物。呼吸链并非其成功的引擎，而是一个灵活的配件，帮助它在特定的挑战性环境中生存，例如感染期间的人类肠道。通过了解这种细菌依赖于独特的“反向驱动电池系统”而非标准的“呼吸引擎”，科学家们或许能找到破坏其能量供应的新方法。这可能会为治疗由粪肠球菌引起的感染提供新的手段，已知该细菌对许多常见抗生素具有耐药性。这项研究表明，击败这种顽强病原体的关键不在于阻断其对氧气的利用，而在于理解它如何独特地管理其内部能量和化学平衡，从而在人体内生存。

技术摘要：界定需氧呼吸在粪肠球菌（Enterococcus faecalis）代谢与生物能量学中的作用

问题陈述
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）是一种兼性厌氧菌，也是一种机会性病原体，主要依赖发酵代谢。已知在存在外源血红素的情况下，粪肠球菌可以组装一个极简的电子传递链（ETC），该链由膜结合型 II 型 NADH 脱氢酶（Ndh2）、去甲基化醌（DMK）和末端细胞色素 bd 氧化酶（CydAB）组成，但该呼吸链对生物能量学的生理贡献仍不明确。此外，粪肠球菌拥有一种胞质 NADH 氧化酶（Nox），它消耗氧气并重新氧化 NADH。目前尚不清楚膜结合型 ETC 与胞质 Nox 哪一个是驱动耗氧的主导因素，这些途径如何相互作用以维持氧化还原和能量稳态，以及 F 型 ATP 合成酶在需氧条件下产生质子动力势（PMF）的具体作用。

方法论
本研究采用了系统性的遗传学和生理学方法，使用野生型粪肠球菌菌株 JH2-2 进行研究。

遗传构建： 利用温度敏感型 pIMAYZ 质粒系统，构建了胞质 NADH 氧化酶缺失突变体（Δnox）、细胞色素 bd 氧化酶缺失突变体（ΔcydAB）、F 型 ATP 合成酶 $\alpha$ 亚基缺失突变体（ΔatpA）以及双突变体（ΔcydABΔnox）。
生长条件： 将菌株培养在添加了血红素的营养丰富培养基（BHI）中，并在两种氧分压下进行实验：常氧（通过摇瓶实现 45% 氧饱和度）和低氧（通过密封血清瓶实现初始 25% 逐渐降至 <1%）。
生理测定：
- 生长指标： 测量了倍增时间、生物量产量（细胞干重）、存活率（CFA/mL）和最终 pH 值。
- 耗氧量： 使用光学传感器点实时监测生长培养物中的氧水平。同时使用 Clark 型电极测量了在葡萄糖驱动的非生长细胞悬浮液中的耗氧率（OCR）。
- 代谢组学： 对处于稳定期阶段的培养物进行了半靶向代谢组学分析，重点评估胞内代谢物池，特别是 ATP/ADP 和 NADH/NAD+ 比率以及中心碳代谢中间产物。
- 膜电位： 利用电压敏感染料 DiSC3(5) 进行单细胞荧光显微成像，用于测量跨膜电位（ $\Delta\Psi$ ）。研究利用离子载体 gramicidin（去极化剂）和 nigericin（ $\Delta$ pH 耗散剂）来剖析 $\Delta\Psi$ 和跨膜 pH 梯度（ $\Delta$ pH）对总 PMF 的贡献。
- 基因表达： 通过启动子报告基因融合（PcydAB-lacZ 和 Pnox-lacZ）确认实验条件下的基因表达情况。

关键结果

生长与生物量： 在测试的实验室条件下，没有任何单一的呼吸组分是生长所必需的。有趣的是，在常氧条件下，ΔcydAB 和 ΔatpA 突变体的倍增时间明显快于野生型。虽然单突变体的生物量产量与野生型相当，但 ΔcydABΔnox 双突变体的稳定期生物量减少了 3.7–4.3 倍，这表明两种氧化酶之间存在生物能量冗余。ΔatpA 突变体的生物量也减少了 1.6–2 倍。
耗氧量： 实时测量和 OCR 分析显示，Nox 是主要的氧消耗者。缺失 nox 会使 OCR 降低 87%，而缺失 cydAB 对 OCR 没有显著影响。这表明 Nox 是粪肠球菌中还原氧气的优势酶。
代谢通量与氧化还原稳态： 代谢组学分析显示，Δnox 突变体面临高 NADH:NAD+ 比率和低 ATP:ADP 比率。这导致了糖酵解上游中间产物（葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸）的积累以及下游代谢物的耗尽，暗示在 NAD+ 依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶步骤处存在阻断。相比之下，ΔcydAB 突变体维持了与野生型相似的氧化还原和能量稳态，尽管其通过磷酸戊糖途径的通量有所增加。
质子动力势（PMF）生成： 单细胞显微成像显示，粪肠球菌维持着极低的稳态膜电位（ $\Delta\Psi$ $ΔΨ$ ）和较高的 $\Delta$ $Δ$ pH。
- ΔatpA 突变体和 ΔcydABΔnox 双突变体的 $\Delta\Psi$ 显著降低。
- 至关重要的是，在使用 nigericin（使 $\Delta$ pH 塌陷）处理后，除 ΔatpA 外的所有菌株都出现了超极化（ $\Delta\Psi$ 增加）现象。
- 这些发现表明，在粪肠球菌中，F 型 ATP 合成酶的主要功能是作为 ATP 驱动的质子泵来产生 PMF，而不是通过 PMF 合成 ATP，即使在需氧生长期间也是如此。

意义与主张
作者得出结论，即使在存在氧气的情况下，粪肠球菌也优先考虑快速的发酵代谢而非呼吸效率。该研究挑战了经典的模型，即需氧呼吸普遍通过氧化磷酸化来提高生长效率。数据支持以下模型：

Nox 是主导氧化酶，它对于维持糖酵解通量所需的 NAD+ 池和氧化还原平衡至关重要，而非用于产生显著的 PMF。
ETC (CydAB) 扮演次要且非必需的角色，在这些条件下对整体耗氧量的贡献较小，但在特定的宿主环境中可能有助于提升适应性。
F 型 ATP 合成酶作为一个由 ATP 水解驱动的质子泵来维持 PMF（特别是 $\Delta$ pH），这一机制使细胞能够在低膜电位的情况下维持生物能量过程。

本文认为，粪肠球菌的生物能量策略定义为维持胞内氧化还原平衡（NADH:NAD+ 比率），而非通过氧化磷酸化实现最大 ATP 产量。这种代谢灵活性使该细菌能够在肠道及其他环境生态位中应对不断变化的氧气和营养条件。这些发现为理解粪肠球菌的生物能量学提供了修正后的视角，表明针对氧化还原平衡或 ATP 合成酶作为质子泵这一特定作用的研究，可能与未来的抗菌策略相关。

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