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Engineering a Thermostable Ketone Amination Reductase from Aspergillus oryzae via Evolution-Based Design

通过将祖先序列重建与结构导向的突变相结合，研究人员成功工程化了米曲霉（*Aspergillus oryzae*）还原胺酶，使变体 Anc74_7 和 Anc75_20 实现了显著增强的催化活性和热稳定性。

原作者： Jiaying Wu, Chuxin Wang, Wenxuan Zhang, Siqi Xu, Ximan Huang, Li Wen, Peiqin Chen, Chunying Jin, Guangya Zhang, Wei Jiang

发布于 2026-07-22

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CC BY 4.0

原作者： Jiaying Wu, Chuxin Wang, Wenxuan Zhang, Siqi Xu, Ximan Huang, Li Wen, Peiqin Chen, Chunying Jin, Guangya Zhang, Wei Jiang

原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 ⚕️ 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。阅读完整免责声明

想象一下你是一位正在尝试烤制完美蛋糕的大师级厨师，但你的烤箱有点难以捉摸。如果温度过高，蛋糕就会塌陷；如果配料不对，味道就会平淡无奇。在科学世界中，这个“厨师”就是酶——一种微小的生物机器，它能加速化学反应。这些机器在构建复杂分子方面表现出色，比如用于制造救命药物和农用化学品的手性胺。然而，就像你那难以捉摸的烤箱一样，许多天然酶非常脆弱。如果温度升高一点，或者它们所处的液体改变了 pH 值或含有酒精，它们就可能停止工作。科学家们一直试图“调优”这些酶，让它们变得更强韧、更快速，但这有点像通过乱扔齿轮来修理一块手表。

为了解决这个问题，研究人员使用了一种聪明的技巧，叫做“祖先序列重建”。把它想象成蛋白质的“时光旅行”。科学家们不仅是微调现代酶，而是观察酶的家族树，并推测其古代、早已灭绝的祖先长什么样。这些古代版本通常拥有“超能力”，比如能够在更高温或更恶劣的环境中生存，因为它们是为了适应不同的世界而进化的。通过在计算机中重建这些古代蛋白质，并将它们最好的特性与现代蛋白质混合，科学家们希望创造出一种既坚韧又高效的“超级酶”。这篇论文正是关于采用这一思路，并观察其是否能有效地改进一种特定的酶——这种酶发现于一种名为 Aspergillus oryzae（米曲菌）的真菌中。

超级酶的故事

在这项研究中，来自华桥大学的一个研究小组决定升级一种名为 AspRedAm 的特定酶。这种酶在实验室里是一个“苦力”；它有助于将简单的化学物质转化为有价值的手性胺，而这些物质是许多药物的构建模块。问题在于？天然版本的 AspRedAm 有点像个“戏精”。如果温度过热（约 40°C）或环境发生变化，它就会变得紧张并崩溃。科学家们想要为它进行一次“大改造”，让它变得更强壮、更快，并能应对更严苛的条件。

时光旅行策略
首先，团队充当了进化侦探的角色。他们收集了来自不同生物的庞大相似酶列表，并构建了一棵家族树。利用计算机程序，他们通过逆向工程推测出了三种古代酶祖先的 DNA 序列，并将它们命名为 Anc43、Anc74 和 Anc75。他们选择这些特定的祖先是因为它们在家族树上处于有趣的节点，暗示它们可能拥有独特的、稳健的特性。

数字工作坊
一旦拥有了这些古代酶的“蓝图”，他们并没有止步于此。他们使用了一个名为 FuncLib 的智能计算机工具来进行“假设”游戏。他们要求计算机更换活性位点（即酶发生魔力反应的部分）中的特定氨基酸（蛋白质的微小构建模块）。他们生成了数百个虚拟版本，并在数字模拟中测试哪些版本最稳定且最擅长捕捉目标分子。

实验室的赢家
通过数字筛选，他们挑选出了顶尖的候选者，并利用细菌在现实中构建了它们。他们在实验室中测试了这些新酶，结果令人兴奋。两个新版本，分别命名为 Anc74_7 和 Anc75_20，成为了全场的明星。

超速： 这些新酶不仅能工作，而且速度更快。Anc74_7 版本比原始版本快了 1.6 倍，而 Anc75_20 则达到了惊人的 2.2 倍。
耐热性： 原始酶在 40°C 下运行一小时后就会开始崩溃。然而，这些新版本却是“硬骨头”。在高达 50°C 的高温下，它们在失去一半活性之前可以持续工作数百小时。事实上，在那个温度下，它们的“半衰期”（失去一半活性所需的时间）比原始酶长了约 377 倍。
溶剂耐受性： 工业过程经常使用酒精或丙酮等溶剂，这些溶剂通常会杀死酶。然而，这些新的突变体可以在这些溶剂中生存并继续工作，在甲醇或 DMSO 中放置 150 分钟后，仍能保留约 80% 的活性。

为什么有效？
科学家们不仅听其言，还通过分子模拟进行了“拆解检查”。他们发现，所做的突变改变了酶“嘴巴”（活性位点）的形状。在新版本中，原料（底物）契合得更紧密，并形成了更强的连接，就像拼图碎片完美地扣在一起一样。这种更紧密的契合意味着酶可以更容易地抓取目标并将其固定，从而开展工作。

模拟还显示，新酶更加紧凑和刚性，就像一个打包整齐的行李箱，而不是一个凌乱的行李箱。这种刚性防止了它们在高温下散架。此外，新酶的表面具有更平衡的电荷，这有助于它们在环境变得复杂时保持稳定。

核心结论
这篇论文表明，将“时光旅行”（祖先重建）与智能计算机设计（半理性设计）相结合，是构建更好酶类的强大方法。他们不仅仅是碰运气；他们设计出了一个显著更稳定且更高效的酶版本。虽然原始的 AspRedAm 有点脆弱，但这些新的亲戚——Anc74_7 和 Anc75_20——已经做好了应对现实世界的准备，未来有望帮助更高效、更可持续地制造药物和化学品。这项研究证明，通过回顾过去并利用现代工具，我们可以设计出能够应对当今工业挑战的生物机器。

技术摘要：通过基于进化的设计工程化构建来自 Aspergillus oryzae 的热稳定性酮胺还原酶

问题陈述
手性胺是医药和农药领域关键的骨架分子，然而其工业合成通常依赖于在苛刻条件下进行的化学催化，或者受限于立体选择性和可持续性的不足。虽然生物催化提供了一种更温和、更具选择性的替代方案，但还原胺酶的应用经常受到底物范围窄、催化效率低以及稳定性差的限制。具体而言，来自 Aspergillus oryse 的还原胺酶（AspRedAm）是一种极具前景的 NADPH 依赖型亚胺还原酶，但表现出显著的局限性，包括热稳定性差（在 40°C 下放置 1 小时后即发生沉淀）和 pH 敏感性。这些缺陷限制了其在工业生物催化中的实际应用，因此需要通过蛋白质工程来增强其鲁棒性和催化性能，同时不损害其活性。

方法论
本研究采用了一种整合了祖先序列重建（ASR）与结构导向半理性突变的基于进化的设计策略。工作流程如下：

系统发育分析与 ASR： 利用从 NCBI 数据库检索到的 41 条 AspRedAm 同源序列构建了系统发育树。使用 PAMLX 中的极大似然法重建了三个祖先节点（Anc43、Anc74 和 Anc75）。选择这些节点是基于它们在进化树中的外围位置（与功能多样化相关）以及显著的序列差异。
确定突变位点： 利用分子对接技术绘制了底物结合口袋，并识别了 AspRedAm 及其三个祖先变体中距离底物 4.0 Å 的关键残基。
半理性设计 (FuncLib)： 利用 FuncLib 服务器生成突变库。通过结合进化保守性分析与 Rosetta 原子级建模，为四种酶（AspRedAm 及三种祖先变体）各生成了 50 个变体结构，共计 200 个初始候选体。
计算机模拟筛选： 候选体通过多因子筛选过程进行过滤：
- 稳定性： 使用 FoldX 预测稳定性变化 ( $\Delta\Delta G$ )，保留具有有利能量分布的变体。
- 结合亲和力： 使用 AutoDock Vina 计算底物和辅因子的对接能量。
- 溶解度： 使用 DeepPredict 估计相对溶剂可及性 (RSA)。
- 动力学： 前 15 个候选体进行了 10 ns 分子动力学 (MD) 模拟，以构建自由能景观 (FEL)，评估构象稳定性和势阱深度。
实验验证： 将选定的三个变体（Anc74_7、Anc75_8 和 Anc75_20）表达于 E. coli BL21(DE3) 中，进行纯化并进行表征。通过酶促实验测量了最佳温度/pH、热稳定性和溶剂稳定性、比活性以及动力学参数（ $K_m$ , $k_{cat}$ , $k_{cat}/K_m$ ）。
机制分析： 通过 100 ns 分子动力学 (MD) 模拟、残基水平自由能贡献分析以及表面 $\zeta$ 电位计算，阐明了观察到的改进的结构基础。

核心贡献与结果
本研究成功工程化了具有显著增强的催化效率和热稳定性的 AspRedAm 变体：

催化性能： 变体 Anc75_20 的比活性比野生型 AspRedAm 高出 2.2 倍，而 Anc74_7 高出 1.6 倍。动力学分析表明，这些改进是由周转数 ( $k_{cat}$ ) 的增加以及在某些情况下底物亲和力 ( $K_m$ ) 的改善驱动的。例如，在使用 1-茚酮作为底物时，Anc75_20 的催化效率 ( $k_{cat}/K_m$ ) 提高了 2 倍以上。
热稳定性： 工程化变体展示了卓越的热韧性。在 50°C 下，Anc74_7 和 Anc75_20 的半衰期比野生型 AspRedAm 长约 377 倍。即使在 30°C 下，这些变体也能保持数百小时的稳定性，其半衰期约为野生型的 187 倍。
溶剂与 pH 耐受性： 突变体在极性溶剂（甲醇、DMSO）中保留了高残余活性（约 80%），并且与野生型相比，对中等极性溶剂（异丙醇、乙酸乙酯）表现出更好的耐受性。它们在强碱性条件（pH 10）下也能维持活性。
结构见解：
- 活性位点重构： 分子对接表明，改进后的变体与底物形成了更稳定的氢键网络（例如涉及残基 Asp280, Ser235, Ala120, Gly153, Ser155），从而实现了更紧密的配体结合并优化了催化定位。
- 构象稳定性： MD 模拟和 FEL 分析显示，变体采用了更紧凑的结构（较低的回转半径）并表现出更小的溶剂可及表面积 (SASA)。FEL 显示其具有更深、更集中的低能势阱，表明突变体比野生型能更有效地稳定催化活性构象。
- 静电优化： 表面 $\zeta$ 电位分析显示，变体具有更均匀的电荷分布，减少了极端的正/负电荷斑块。这可能有助于通过最小化表面电荷扰动来提高其对 pH 波动和有机溶剂的耐受性。

意义
本文声称，这项工作展示了将祖先序列重建与结构导向半理性设计（特别是使用 FuncLib）相结合，用于开发高性能生物催化剂的效用。通过推断已灭绝的祖先序列，并通过计算设计和实验筛选进行精炼，作者成功克服了 AspRedAm 固有的稳定性与活性限制。该研究提供了一个实用的酶工程框架，证明了可以在不损害结构稳定性的情况下显著提高催化效率。所得变体为手性胺的不对称合成提供了稳健的平台，解决了对能在多种挑战性工艺条件下有效工作的酶的需求。

超级酶的故事

技术摘要：通过基于进化的设计工程化构建来自 Aspergillus oryzae 的热稳定性酮胺还原酶

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