Dichlorotetrazine-Mediated Peptide Cyclodimerization Enables Exponential Expansion and Topological Diversification of Peptide Libraries

技术摘要：二氯四嗪介导的肽类环二聚化

问题陈述
由于肽类药物具有高靶向选择性和优于小分子的安全性，其正经历复兴，但新肽类先导化合物的发现仍是一个瓶颈。虽然生物展示平台（如噬菌体或 mRNA 展示）提供了极高的通量，但它们难以处理非天然氨基酸和非天然构建单元。相反，基于组合化学的库（如 OBOC、DELs）可以容纳多样化的非天然元素，但其通量受到限制（通常上限约为 $10^9$ 个成员），且往往局限于线性肽，拓扑多样性有限。现有的扩展库多样性的策略主要依赖于修改现有骨架（例如连接子变化或立体化学），而非从根本上改变肽骨架以创建新的结构类别。目前迫切需要一种能够指数级扩展库通量，同时引入多样化、复杂拓扑结构的方法。

方法论
作者报告了一种偶然发现的反应，利用 3,6-二氯-1,2,4,5-四嗪 (3,6-DCT) 来介导线性肽的环二聚化。研究采用了系统化的方法：

1. 反应优化： 使用包含 N-端半胱氨酸和内部半胱氨酸的模型肽 (CRGDpPRGDC, L1)，通过筛选条件（pH、浓度、3,6-DCT 当量以及溶剂）进行研究。
2. 机理阐明： 利用 LC-MS、对照实验（N-端乙酰化、半胱氨酸突变）以及全面的 NMR 光谱分析（1D, 2D COSY, TOCSY, HSQC, HMBC, ROESY）来确定反应路径和产物结构。
3. 底物范围验证： 测试了广泛的生物活性肽（5–21 个残基），包括具有 $\beta$-发夹基序、带电残基以及源自噬菌体/mRNA 展示序列的肽，以评估序列的通用性。
4. 库扩展演示： 将 $N$ 种不同的肽等摩尔混合，并与 3,6-DCT 反应，以观察同型二聚体和异型二聚体的形成。
5. 功能化与应用： 展示了在嵌入的四嗪基团上进行正交点击化学的能力（使用 BCN-DOTA），并随后在过表达 FAP 的小鼠模型中进行 $^{68}$Ga 放射性标记分子成像研究。

核心贡献与结果

• 发现四步级联机制： 该反应通过特定的序列进行：(1) 在 N-端硫醇处发生区域选择性 $S_NAr$ 反应；(2) 分子内 [1,4] S-to-N 重排（将四嗪转移至 N-端胺并释放硫醇）；(3) 释放的硫醇通过分子间氧化二聚化形成中心二硫键；(4) 通过 C-端硫醇与剩余四嗪氯之间的分子内 $S_NAr$ 反应终止。这导致了 N,S-不对称的钉合二聚体。
• 结构多样性： 反应产生两种截然不同的拓扑异构体 (B1a 和 B1b)。NMR 分析证实，尽管它们具有相同的共价连接性（N-端二硫键、N-Ar 键、C-端 S-Ar 键），但它们拥有本质上不同的三维架构。
• 广泛的底物耐受性： 该反应对序列多样性、二级结构（包括 $\beta$-发夹）和电荷分布具有高度耐受性。它能有效作用于 5 至 21 个残基的肽，包括具有反应性侧链（Lys, Tyr, His）以及来自生物筛选平台的序列。关键在于，该反应严格要求游离的 N-端胺和 N-端半胱氨酸；N-端乙酰化或 N-端半胱氨酸突变会消除环二聚化过程。
• 指数级库扩展： 研究表明，混合 $N$ 种线性肽会产生 $N(N+1)/2$ 个独特的双环产物（包括同型和异型二聚体）。当混合 10 种不同的肽时，该系统产生了 55 个独特的双环支架及其拓扑异构体，与输入的线性库相比，实现了化学空间的指数级扩张。
• 功能多样性： 嵌入的四嗪基团允许正交生物偶联。作者通过点击化学成功合成了 FAP 靶向的放射性示踪剂（[68Ga]-FAP-B36 变体）。体内 PET/CT 成像显示，与单体相比，二价环二聚体示踪剂表现出更优越的肿瘤摄取和信噪比，这归功于多价效应。

意义
本文声称，这种由 3,6-DCT 介导的环二聚化提供了一个强大的、通用的“一锅法指数级扩展”肽库平台。通过将线性库转化为拓扑多样化的双环架构，该策略解决了化学库通量低和生物展示拓扑多样性不足的双重局限。作者认为，这种方法为先导化合物发现提供了新的结构支架，使得以前无法获取的新分子实体得以实现筛选。此外，四嗪连接的可切割性质以及在暴露的硫醇上进行二次功能化的能力，暗示了其进行多维优化和命中化合物解码的潜力，使该化学技术成为下一代肽类药物研发的重要进展。