Single-cell discovery of mTOR-associated microglial clusters in human mTORopathies

技术摘要：人类 mTOR 疾病中 mTOR 相关小胶质细胞簇的单细胞发现

问题陈述
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）稳态、突触修剪和大脑发育过程中电路细化过程的关键调节因子。虽然小胶质细胞的异质性在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）中已得到广泛表征，但在发育性脑疾病中的情况仍知之甚少。结节性硬化综合征（TSC）和 II 型局灶性皮质发育不良（FCD）是由于 mTORC1 过度激活导致皮质畸形、药物难治性癫痫及神经发育共病的 mTOR 疾病。作者假设，这些发育性疾病中的 mTOR 失调重塑了小胶质细胞图谱，促进了独特的激活状态并改变了神经元-小胶质细胞间的通信，这可能导致了网络不稳定性。

方法学
本研究采用了一种多模态方法，将单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）与免疫荧光（IF）验证以及计算细胞-细胞通信分析相结合。

• 队列： 皮层组织取自 TSC 患者（$n=5$）、携带 MTOR 突变的 FCD 患者（$n=5$）以及携带 DEPDC5 突变的 FCD 患者（$n=3$）。年龄和区域匹配的对照组皮层组织（$n=3$）取自无神经系统病史的尸检捐赠者，作为基线。
• scRNA-seq： 对额叶皮层组织进行解离，并使用 10x Genomics Chromium Single Cell Gene Expression Flex 方案进行处理。每个样本测序约 8,000 个细胞。
• 生物信息学： 使用 Cell Ranger 和 Seurat (v5.0.1) 进行数据处理。通过倒数主成分分析（RPCA）进行质量控制和整合后，基于典型标记物（如 P2RY12、CX3CR1、TMEM119）识别小胶质细胞簇。根据特定标记物的表达排除了外周巨噬细胞和 T 细胞。
• 分析： 使用伪块（pseudo-bulk）策略进行差异表达分析（DESeq2）。通过功能富集（基因本体论，GO）和疾病本体论富集（DisGeNET）来表征簇的功能。使用 CellChat R 包推断细胞-细胞通信网络，以分析小胶质细胞与其他皮层细胞类型之间的配体-受体相互作用。
• 验证： 对来自 TSC、FCD_mTOR 和 FCD_DEPDC5 病例的 FFPE 组织切片进行免疫荧光染色，以验证 scRNA-seq 簇中识别出的标记蛋白表达（特别是 HLA-DR、CCL2、GPNMB 和 ISG15）。

关键结果
研究识别了一个包含十个转录截然不同的簇的复杂小胶质细胞图谱。在排除外周免疫细胞和应激相关簇（在对照组中富集）后，分析聚焦于八种小胶质细胞状态。

1. 共享的小胶质细胞状态： 三种小胶质细胞群体在 mTOR 疾病样本和对照样本之间共享，保留了核心转录身份：

   • 簇 1（稳态型）： 以高表达典型标记物（P2RY12、CX3CR1、TMEM119）和免疫传感通路为特征。该簇的重塑主要具有 TSC 特异性。
   • 簇 2（突触相关型）： 富集了神经元和突触转录本（如 NPTX1、VGF），表明存在活跃的小胶质细胞-神经元相互作用。
   • 簇 3（低反应型）： 以与免疫信号传导和运动性相关的基因程序普遍下调为特征，表明呈现一种功能减弱的表型。

2. mTOR 相关小胶质细胞簇： 与对照组相比，三种独特的小胶质细胞群体在 mTOR 疾病组织中显著扩张：

   • 簇 0（脂质相关 DAM 样型）： 定义为上调脂质处理基因（TREM2、APOE、GPNMB、SPP1）和抗原提呈通路。疾病本体论将此簇与神经退行性疾病联系起来。
   • 簇 4（促炎型）： 以炎症介质（IL1B、TNF、CCL2、CCL3）和 NF-κB 信号组件的协调上调为特征。该簇还显示出对突触调节通路的富集。
   • 簇 7（干扰素响应 DAM 样型）： 由强大的干扰素驱动转录程序（ISG15、MX2、IFIT2、OAS2）定义，表明先天免疫传感和抗病毒防御机制的激活。

3. 改变的细胞-细胞通信：

   • 全局重塑： 网络重塑在 TSC 中最为显著，其次是 FCD_mTOR，而 FCD_DEPDC5 的变化较为温和。
   • 抑制性回路破坏： 在 GABA 能神经元与突触相关小胶质细胞簇（簇 2）之间的通信中观察到了显著的变化。在 TSC 和 FCD_mTOR 中，观察到从 GABA 能神经元向小胶质细胞信号传导的选择性减少，同时伴随着从小胶质细胞向 GABA 能神经元信号传导的增加。这表明抑制性回路的功能重编程。相比之下，FCD_DEPDC5 表现出不同的极性，即增加的 GABA 能输入至小胶质细胞。
   • 小胶质细胞内信号传导： 稳态型和低反应型簇在 mTOR 疾病中表现出减弱的细胞内信号传导强度。

4. 验证： 免疫荧光证实了在人类 mTOR 疾病组织中存在共表达 CCL2（促炎）、GPNMB（脂质相关）和 ISG15（干扰素响应）的 HLA-DR+ 细胞，从而验证了转录组学发现。

意义与主张
作者声称，这项研究提供了人类 mTOR 疾病中小胶质细胞图谱的首个单细胞分辨率图谱。其主要贡献包括：

• 识别新型状态： 发现了三种特定的 mTOR 相关小胶质细胞簇（脂质相关、促炎和干扰素响应型），这些状态扩展了已知的经典神经退行性背景下的小胶质细胞激活状态谱系。
• 功能重编程： 研究发现，虽然共享小胶质细胞群体的核心转录身份得以保留，但其细胞间通信网络发生了显著改变，特别是在抑制性神经回路中。这表明 mTOR 疾病中的小胶质细胞功能障碍涉及信号动力学的重编程，而非身份的完全丧失。
• 共享机制： 疾病本体论分析将这些 mTOR 相关小胶质细胞状态与神经发育和神经退行性疾病联系起来，表明 mTOR 信号可能作为一个收敛的调节轴，驱动不同疾病病因下共享的小胶质细胞激活状态。
• 治疗意义： 干扰素响应型小胶质细胞状态的识别表明，调节干扰素信号通路（例如，通过 JAK-STAT 抑制）可能是抑制适应不良的小胶质细胞激活并恢复 mTOR 疾病中网络稳定性的新治疗策略。

文章得出结论，mTOR 过度激活驱动了异质且依赖于背景的小胶质细胞图谱，其中与抑制性神经元的通信改变可能有助于观察到的网络过度兴奋和癫痫。