In vitro activation of µ opioid receptor and cardiac voltage-gated potassium channels hERG and KV7.1/KCNE1 of orphine analogs and their detections in forensic casework

技术摘要：Orphine 类似物对 $\mu$ 阿片受体及心脏电压门控钾通道的体外激活作用

问题陈述
随着监管控制的加强，合成阿片类药物市场正在迅速演变。在芬太尼类似物受到限制以及中国随后禁止硝氮类（nitazene）类似物（2019–2025年）之后，一种被称为“orphine”（或称“奥芬”）类似物的苯并咪唑酮衍生物已出现在娱乐性药物市场上。虽然阿片类药物的主要风险是由 $\mu$ 阿片受体（MOR）介导的呼吸抑制，但这些物质同时也构成了显著的心脏风险。具体而言，对心脏电压门控钾通道 hERG (KV11.1) 的抑制会导致心室复极延迟，进而引发 QT 间期延长、尖端扭转性室性心动过速（TdP）和猝死。尽管出现了如 brorphine、chlorphine 以及新型变体（例如 cychlorphine、spirochlorphine）等 orphine 类物质，但它们关于 MOR 激动作用和心脏通道抑制（hERG 和 KV7.1/KCNE1）的具体药理学特征仍很大程度上未得到表征。此外，在法医鉴定和查获材料中检测这些物质，对于理解其危害潜力具有紧迫性。

方法学
本研究采用了一种结合了法医毒理学、体外药理学和计算机模拟（in silico）的多维度方法：

1. 法医检测：

   • 查获样本： 使用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对来自瑞典（2020–2026年）的查获材料进行定性分析。首次鉴定通过核磁共振（NMR）进行确认。
   • 死后病例： 使用 LC-MS/MS 对六例尸检病例（2024年8月–2025年12月）的股血进行定量分析，以确定 orphine 及其共摄入物质的浓度。

2. 体外药理学：

   • MOR 活性： 使用表达人类 MOR 和 apoaequorin 的重组 CHO-K1 细胞进行胞内钙释放实验。通过生成浓度-反应曲线来确定 11 种 orphine 类似物的 $EC_{50}$ 和 $E_{max}$ 值，并以芬太尼作为对照。
   • 心脏通道活性： 在稳定表达 hERG (KCNH2) 和 KV7.1/KCNE1 通道的 CHO-K1 细胞上，使用自动膜片钳电生理技术（QPatch II 系统）进行实验。采用电压阶梯和电压脉冲方案来测量通道电导（$G/G_{max}$）和电压依赖性（$\Delta V_{50}$）。计算了用于 hERG 抑制的 $IC_{50}$ 值。

3. 计算机模拟：

   • 使用 GNINA（一种基于深度学习增强的对接程序）在与 astemizole 结合的 hERG 冷冻电镜结构（PDB: 8ZYO）上进行分子对接模拟。旨在阐明结合模式和结构-活性关系（SARs）。

主要贡献与结果

• 法医发现： 研究报告了在瑞典八起查获案件（2020–2026年）和六起死后病例（2024–2025年）中检测到 orphine 类物质。

  • 检测到的物质： 在粉末、鼻喷雾、电子烟液和玻璃烟斗中鉴定了 brorphine、cychlorphine（N-丙烯腈基 chlorphine）和 spirochlorphine。
  • 死后发现： 在六起死亡病例（四起意外死亡，两起自杀）中检测到了 cychlorphine，其股血浓度范围为 0.5 至 16 ng/g。其中四例涉及与其他阿片类药物、苯二氮卓类药物和兴奋剂的混合中毒。一例涉及 5,6-二氯代 nor-orphine 与 5,6-二氯代 brorphine 的共同检测。

• MOR 药理学：

  • 效力： Cychlorphine 是最强的类似物，其 $EC_{50}$ 为 0.188 nM，使其效力约为芬太尼的 5.3 倍。
  • 效能： 大多数类似物表现为全激动剂（$E_{max}$ 为 97.3–104%）。
  • 结构-活性关系 (SAR)：
    • N-苯基上的卤素取代影响效力：Br > Cl > I > H > F。
    • 螺哌啶（Spiropiperidine）类似物与哌啶（piperidine）类似物的 SAR 不同；例如，spirochlorphine 的效力低于 chlorphine，而 spirobrorphine 的效能高于 brorphine。
    • 添加丙烯腈基团（cychlorphine）会增加效力，而 5,6-二氯代取代则显著降低了效力（例如，5,6-二氯代 nor-orphine 在 60 $\mu$M 时未达到饱和）。

• 心脏通道抑制 (hERG 和 KV7.1/KCNE1)：

  • hERG 抑制： 11 种 orphine 中的 8 种完全抑制了 hERG 通道电导。其 $IC_{50}$ 值范围为 0.100 $\mu$M 至 5.47 $\mu$M。
    • 效力排序： 碘取代产生的效力最高（I > Br > Cl > F $\approx$ H）。Iodorphine 是最强的 hERG 抑制剂。
    • 动力学： Orphine 显示出快速、可逆的阻断作用，而 iodophine 则表现出进行性抑制且在洗脱后恢复有限，这表明其解离缓慢或存在膜滞留现象。
    • SAR： 5,6-二氯代取代降低了 hERG 抑制的效力和效能。
  • KV7.1/KCNE1 抑制： 四种 orphines（orphine, fluorphine, brorphine, iodorphine）显著抑制了 KV7.1/KCNE1 电导，尽管其效应比 hERG 弱。Iodophine 引起了电压依赖性的轻微正移。

• 分子对接：

  • 对接模拟表明，orphines 结合在 hERG 通道的典型内腔中，占据了与 astemizole 相同的位点。
  • 关键相互作用涉及所有四个蛋白质单体中的 Tyr652 残基之间的 $\pi$-$\pi$ 和 $\pi$-阳离子相互作用。哌啶胺与 astemizole 的哌啶核心重叠，而苯并咪唑酮基团则延伸至中心腔。

意义与主张
作者得出结论，orphine 类似物的出现代表了一种重大的公共卫生威胁，其特征是双重风险谱：

1. 呼吸抑制： 大多数 orphines 都是强效的 MOR 激动剂，cychlorphine 的效力甚至超过了芬太尼。这表明存在高度致命的呼吸抑制风险，特别是在多药混合中毒的情况下。
2. 心脏毒性： 大多数 orphines 对 hERG（以及在较小程度上对 KV7.1/KCNE1）的强效抑制表明，存在 QT 间期延长、心律失常（包括 TdP）和猝死的风险。
3. 临床意义： 由于纳洛酮可以逆转阿片受体激活，但不能逆转 hERG 抑制或 QT 间期延长（如芬太尼所示），作者建议，对于疑似使用 orphine 的个体，即使在给予纳洛酮治疗后，也应进行针对 QT 间期延长和心律失常的 ECG 监测。

该研究强调，中国对硝氮类物质的管控直接催化了向 orphine 类似物的转变，而这些类似物除了阿片类激动作用外，还具有独特的、可能极其严重的心脏毒性特征。这些物质在多种给药系统（鼻喷雾、电子烟）中的检测进一步增加了评估其危害潜力的复杂性。