A CTLA4–TIGIT Prognostic Signature and Checkpoint Blockade Efficacy in Oral Squamous Cell Carcinoma

技术摘要：口腔鳞状细胞癌中的 CTLA4–TIGIT 预后特征与检查点阻断疗效

问题陈述
尽管针对 PD-1 的免疫检查点抑制剂（ICIs）改善了复发/转移性头颈部鳞状细胞癌（HNSC）的预后，但客观缓解率仍局限于 15–20%。在 HNSCC 中，CTLA4、TIGIT 和 LAG3 这些共抑制受体经常在耗竭的 CD8+ 肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）上共同表达，然而，它们作为一个具有治疗可行性的预后轴在口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的整合作用尚未得到系统性评估。现有的预后模型通常依赖于缺乏直接药物靶向性的庞大基因组（7–24 个基因），且很少有研究将转录组特征描述与特定检查点阻断的体内功能验证相结合。

方法学
本研究采用了整合多组学与临床前研究的方法：

1. 转录组分析： 分析了来自 TCGA-HSC（n=467）的批量 RNA-seq 数据和来自 GEO（OSCC: GSE23558, n=32; OSF: GSE64216, n=8）的微阵列数据。使用经 Benjamini-Hochberg 校正的 Wilcoxon 秩和检验评估了 CTLA4、TIGIT 和 LAG3 的差异表达。
2. 免疫浸润估计： 使用 immunedeconv R 包（整合了六种算法：TIMER、xCell、MCP-counter、CIBERSORT、EPIC、quanTIseq）来估计免疫细胞组成。计算了检查点表达与 CD8+ T 细胞丰度之间的 Spearman 相关性。
3. 预后建模： 应用 LASSO Cox 回归对这三个检查点基因进行分析，以构建总生存期（OS）的风险评分。根据中位数得分将患者分为高风险组和低风险组。
4. 单细胞定位： 利用 TISCH 数据库中的汇总级单细胞 RNA-seq 数据（数据集 HNSC_GSE103322、HNSC_GSE180268、OSCC_GSE172577）将 CTLA4 和 TIGIT 的表达映射到九种注释的细胞谱系中。
5. 体内验证： 使用同基因小鼠模型（在 C57BL/6 小鼠中接种 SCC7 细胞，n=6/组）来评估单药阻断的疗效。小鼠接受腹腔注射抗 CTLA4、抗 TIGIT、抗 LAG3 或抗 IgG 同型对照（每 3 天 200 µg，共 4 剂）。监测肿瘤体积、重量及体重。在第 21 天进行 CD8 和 FoxP3 的免疫组织化学（IHC）染色。

主要结果

• 表达与相关性： 在 TCGA-HNSC 队列中，CTLA4 和 LAG3 在肿瘤与正常样本之间呈显著差异表达（FDR < 0.05），而 TIGIT 则不然。然而，所有三种检查点均与 CD8+ T 细胞丰度表现出强正相关（CTLA4: r=0.465; TIGIT: r=0.611; LAG3: r=0.652）。
• 预后特征： LASSO 回归得出了一个双基因风险评分：风险评分 = −0.0945 × TIGIT − 0.0738 × CTLA4。LAG3 被排除在最终评分之外（系数 = 0）。该评分能显著区分患者的高、低风险组（Log-rank P = 0.00048; HR = 1.64, 95% CI 1.24–2.18），高风险组的总体生存期较差。
• 单细胞定位： 单细胞 RNA-seq 数据证实，CTLA4 和 TIGIT 的表达主要定位于 CD8+ T 细胞，其次是 Treg 和 NK 细胞，这支持了批量转录组信号的免疫细胞来源。
• 体内疗效： 与同型对照相比，单药阻断 CTLA4、TIGIT 或 LAG3 均显著降低了肿瘤重量和第 21 天的肿瘤体积（所有 Holm 校正后 P < 0.05）。与抗 CTLA4 和抗 LAG3 相比，抗 TIGIT 治疗的效果幅度较小。未观察到体重显著差异，表明该模型具有耐受性。IHC 评分显示治疗组中的 CD8 和 FoxP3 数值较低，但由于缺乏定义的评分量表，研究指出这些发现对于免疫细胞密度的判断是无法解释的。

意义与主张
作者声称已在 HNSCC 转录组数据中识别出一种 T 细胞相关的 CTLA4–TIGIT 预后信号，该信号可独立对总生存期进行分层。他们证明了在同基因小鼠模型中，单独阻断 CTLA4、TIGIT 或 LAG3 均能抑制已建立的 OSCC 肿瘤生长。

至关重要的是，本文对临床应用保持了审慎的态度：

• 该 CTLA4–TIGIT 评分被呈现为一种源自标准疗法队列（TCGA）的 预后生物标志物，而非经过验证的用于预测免疫治疗获益的 预测性生物标志物。
• 作者明确指出，该评分尚未在接受 ICI 治疗的队列中得到验证，其预测效用仍未经过评估。
• 体内研究结果被定性为初步证据，表明每种受体都对 SCC7 模型中的免疫抑制有贡献，这为联合策略提供了动力，但并未对其进行验证。
• 研究强调，虽然该双基因评分具有简洁性且源自可成药靶点，但在临床转化前，仍需在 OSCC 特异性队列中进行独立验证，并在接受 ICI 治疗的患者中进行前瞻性评估。

文章总结道，虽然综合分析支持 CTLA4–TIGIT–LAG3 轴的生物学相关性，但进一步的联合阻断临床前评估以及严格的预测性验证是临床应用的前提条件。