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Production of L-asparaginase by Pseudomonas reptilivora ATCC 13626 (NRRL B-6bs): First fractional factorial screening and discovery of ureolytic activity

本研究报告了对解剖假单胞菌（*Pseudomonas reptilivora*）ATCC 13626 生产 L-天冬酰胺酶进行的首次系统性筛选，确定了低搅拌强度和天冬酰胺补充是实现高酶产量的关键因素，同时发现了一种可诱导的尿素分解能力，这对该物种的经典分类提出了挑战。

原作者： Carlos Tinoco-Gutierrez, Hugo Israel Olvera-Calderón, Itan Homero Ruiz-Hernandez, Juan Carlos González-Hernández

发布于 2026-08-04

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CC BY 4.0

原作者： Carlos Tinoco-Gutierrez, Hugo Israel Olvera-Calderón, Itan Homero Ruiz-Hernandez, Juan Carlos González-Hernández

原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 ⚕️ 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。阅读完整免责声明

想象一下，在你体内有一个微小且隐形的工厂，它正遭受着一种非常狡猾的敌人攻击：一种被称为急性淋巴细胞白血病的血液癌症。为了对抗这种疾病，医生们使用了一种特殊的工具——一种名为 L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）的生物机器，也就是一种酶。你可以把这种酶想象成一个饥饿的吃豆人，专门吞噬一种叫做天冬酰胺的特定营养物质。癌细胞就像一群忘记了如何自己制作零食的贪婪小孩；一旦你夺走了它们的天冬酰胺，它们就会因饥饿而死亡，而健康的细胞因为能够自己制作零食，所以能继续生存下去。

目前，医生们使用的“吃豆人”工具是由大肠杆菌（E. coli）这类细菌制造的。但这些工具存在一些问题：它们会被人体的免疫系统过快地吞噬（就像手中的饼干碎掉一样），而且有时会导致身体产生过敏反应。科学家们一直在寻找新的、更好的工厂，以便在不引起麻烦的情况下生产这种酶。他们正在寻找那些生命力顽强、效率高，甚至可能带点惊喜色彩的细菌。这就是一种名为 Pseudomonas reptilivora（一种假单胞菌）的特定微生物的故事。科学家们长期以来一直了解这种细菌，但在生产这种特定酶方面，他们认为它有点乏味。他们还认为它无法食用一种常见的氮源——尿素。但如果他们错了呢？

微生物的大变身

在这项研究中，研究团队决定给 Pseudomonas reptilivora 做一次“大变身”。他们想看看是否能唤醒这种细菌，并让它大量生产这种抗癌的 L-天冬酰胺酶。他们在一些小玻璃瓶中进行了一系列实验，这就像一场烹饪秀，他们在测试不同的配方，看看哪一个能做出最好的蛋糕。

科学家们测试了三种主要成分，以观察它们如何影响细菌的表现：

搅拌（Agitation）： 摇晃玻璃瓶的速度（就像搅拌锅里的东西）。他们测试了慢速搅拌（150 rpm）和快速搅拌（230 rpm）。
尿素（Urea）： 一种他们认为可能有助于生产、也可能有害的氮源。
天冬酰胺（Asparagine）： 这种酶所吃的特定营养物质，他们希望它能起到开启酶生产信号的作用。

大惊喜：尿素行不通

第一个重大发现是一个完全出乎意料的剧情转折。几十年来，教科书都说这种特定的细菌是“尿素酶阴性”的，意味着它不能分解尿素。这就像是说一只狗不会叫一样。但是，当研究人员将这种细菌放在一个只有尿素作为食物的特殊培养皿中时，细菌不仅存活了下来，而且生长得非常茂盛，并将培养皿变成了粉红色，这证明它们确实在分解尿素。他们甚至发现，这种细菌可以在没有任何其他食物来源的汤液中生长，证明它们拥有通过食用尿素来生存的秘密超能力。这是第一次有人看到 Pseudomonas-reptilivora 展示这种能力。事实证明，这种细菌一直在隐藏这种能力，等待着合适的条件来展示自我。

成功的秘诀

在制造 L-天冬酰胺酶方面，研究人员发现“配方”至关重要。他们发现细菌对摇晃的力度非常敏感。

摇晃速度： 当他们摇晃玻璃瓶太快时（230 rpm），细菌会感到压力，导致酶的产量下降。这就像是在别人踢沙子的时候试图堆沙堡；结构会崩塌。但当他们将摇晃速度放慢到 150 rpm 时，细菌变得快乐且平静，酶的产量随之飙升。
原料： 加入更多的天冬酰胺（最高达每升 5 克）就像是一个绿灯，告诉细菌开始大量生产酶。然而，加入尿素则像是一个红灯。尽管细菌可以食用尿素，但在混合物中加入尿素实际上阻止了它们制造所需的酶。这就像是细菌吃得太饱了，以至于懒得再去制作那种特殊的药物。

最终得分

通过将慢速摇晃（150 rpm）与高剂量的天冬酰胺以及零尿素相结合，团队成功中了头奖。他们设法让细菌生产出了 113.76 ± 7.60 U/mL 的酶。与之前已知的该特定菌株的产量（仅约 70 U/mL）相比，这是一个巨大的飞跃。他们还发现这种酶非常高效，其比活性为 0.30 ± 0.02 U/mg protein·min。

下一步计划

研究人员非常确定他们找到了一个很好的起点，但也深知自己尚未到达终点。数据呈现出一种“曲线”模式，这意味着完美的配方不仅仅是他们测试过的成分之间的一条简单的直线；最理想的点可能位于一个更复杂的地图中间的某个位置。他们建议，未来的实验应该使用一种更先进的绘图技术（称为响应面法，Response Surface Methodology），以找到速度与原料之间的绝对完美组合。

因此，故事以一个快乐的发现结束：一种曾被认为乏味且无法食用尿素的细菌，实际上是一个隐藏的瑰宝。只要有合适的温柔摇晃和正确的零食，它就能变成制造对抗白血病药物的强大工厂。这提醒我们，即使在微观世界里，也总是有新的秘密等待着被搅动出来。

技术摘要：利用 Pseudomonas reptilivora ATCC 13626 生产 L-天冬酰胺酶

问题陈述
L-天冬酰胺酶（EC 3.5.1.1）是治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）和霍奇金淋巴瘤的关键治疗酶，其通过耗尽细胞外天冬酰胺，从而诱导白血病细胞发生代谢饥饿。然而，目前源自 Escherichia coli 和 Erwinia chrysanthemi 的商业制剂受限于高免疫原性率（30–70%）和较短的半衰期。虽然研究人员已经探索了多种微生物宿主，但产量差异显著，且需要具有改进生物工艺特性的替代来源。Pseudomonas reptilivora ATCC 13626 (NRRL B-6s) 在历史上被注意到具有基础的 L-天冬酰胺酶活性，但作为生产宿主仍未得到充分开发。此外，该菌株在经典分类中被归为脲酶阴性，这一状态可能无法反映其完整的代谢可塑性。

方法论
本研究采用系统的分数阶析因筛选方法，通过摇瓶深层发酵法优化了 P. reptilivora ATCC 13626 生产 L-天冬酰胺酶的过程。

实验设计： 使用 $2^{3-1}$ 分数阶析因设计（分辨率 III）来评估三个操作因子：搅拌速度（150–230 rpm）、尿素浓度（0–10 g/L）和 L-天冬酰胺浓度（1–5 g/L）。该设计包括四个析因实验组和两个中心点，实验进行三次生物学重复。
培养条件： 发酵在添加了特定氮源的胰蛋白酶大豆胨 broth (TSB) 中进行。培养物在 28–30 °C 下孵育 48 小时。
分析方法：
- 酶活性： 通过改良的天冬氨酸羟氨裂解法对 L-天冬酰胺酶活性进行定量，该方法需要破碎细胞以获取周质酶组分。
- 脲酶活性： 通过三种独立的实验评估脲解能力：改良的无蛋白素 Christensen 尿素琼脂上的定性颜色变化、在以尿素作为唯一氮源的无蛋白素培养基中的生长情况，以及通过脲耦合 Berthelot 法进行的定量尿素消耗追踪。
- 动力学： 监测随时间变化的生物量（OD $_{600}$ 和干细胞重量）、葡萄糖消耗量和尿素浓度。在指数生长期计算动力学参数（比生长速率、倍增时间、比生产速率）。
统计分析： 数据使用 Minitab® 18 进行分析，采用析因回归、帕累托图（Pareto charts）和方差分析（ANOVA）来确定显著因子和曲率。

关键结果

L-天冬酰胺酶产量： 在 48 小时、低搅拌（150 rpm）、5 g/L L-天冬酰胺且无尿素的情况下（处理组 T4），实现了最大体积活性 113.76 ± 7.60 U/mL 和比活性 0.30 ± 0.02 U/mg protein·min。
析因效应：
- 搅拌： 这是主要的显著因子。低搅拌（150 rpm）显著增强了比活性和比生产速率 ( $q_P$ )，而高搅拌（230 rpm）则抑制了这些指标，这可能是由于流体动力剪切应力破坏了细胞膜。
- 底物： L-天冬酰胺是一种强诱导剂，而尿素则起到了抑制作用。尿素的存在通常会降低比活性，表明存在氮代谢物阻遏（NMR）现象。
- 统计显著性： 虽然由于自由度有限，体积活性的线性模型缺乏统计学意义，但比活性和 $q_P$ 对搅拌表现出显著性（分别为 $p=0.015$ 和 $p=0.012$ ）。
动力学与生长： 所有处理组均表现出双相生长模式，D-葡萄糖在最初 24 小时内耗尽，随后利用次级氮源。L-天冬酰胺酶的合成在葡萄糖耗尽后加速。
脲解能力的发现： 与其历史分类相反，P. reptilivora ATCC 13626 展示了诱导型脲解能力。证据包括尿素琼脂上明显的 pH 变化（由黄变粉）、在以尿素作为唯一氮源的无蛋白素培养基中持续生长，以及定量的尿素消耗。这表明该菌株拥有功能性的脲酶系统，尽管其分子水平的确认（通过 ureABC 测序）尚在进行中。
非线性： 在所有响应变量中均检测到显著的曲率（ $p \leq 0.037$ ），表明该系统表现出非线性行为，且全局最优值位于当前实验范围之外。

意义与声明
本文声称 P. reptilivora ATCC 13626 是一个高产的 L-天冬酰胺酶来源，在未经广泛优化的情况下，产量较历史基础水平（70 U/mL）提高了 62%。研究确定了低搅拌和无尿素是最大化酶滴度的关键工艺杠杆。

至关重要的是，这项工作报告了首次发现该物种的脲解活性，挑战了其长期以来的脲酶阴性分类。这一发现扩展了 P. reptilivora 已知的代谢谱，并暗示了一种可能在压力条件下影响酶生产的氮清除机制。

作者得出结论，虽然目前的筛选提供了坚实的基础，但观察到的非线性行为要求进行后续研究，即使用响应面法（RSM），特别是 Box–Behnken 设计，以实现工业规模化生产的完全优化。本文将 P.-reptilivora 定位为一种极具前景的治疗酶生产候选菌株，尚需进一步的生化表征和脲酶系统的分子验证。

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