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A gFET-based Sensor Equipped with a Focused Post-SELEX Aptamer Library for Specific Quantification of the Hormone-like Anti-Aging Protein Klotho in Human Serum

本研究开发了一种高灵敏度、无标记的石墨烯场效应晶体管 (gFET) 传感器，该传感器配备了经过定向后 SELEX 筛选的适配体库，旨在实现对人类血清中抗衰老蛋白 Klotho 及其关键 KL1 结构域的特异性且快速的定量分析。

原作者： Runliu Li, Shengnan He, Daniel Gruber, Markus Krämer, Andreas Stürmer, Roger Hasler, Christoph Kleber, Wolfgang Knoll, Ann-Kathrin Kissmann, Frank Rosenau

发布于 2026-08-25

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CC BY 4.0

原作者： Runliu Li, Shengnan He, Daniel Gruber, Markus Krämer, Andreas Stürmer, Roger Hasler, Christoph Kleber, Wolfgang Knoll, Ann-Kathrin Kissmann, Frank Rosenau

原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 ⚕️ 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。阅读完整免责声明

衰老不仅仅是时间的流逝，它是一个生物学过程，逐渐改变着我们组织和器官的功能方式，往往为心脏病、肾衰竭和记忆力丧失等严重疾病铺平道路。几十年来，科学家们一直在寻找一种可靠的方法来衡量人体对这种衰退的内部抵抗力。一个极具前景的候选者是一种被称为 Klotho 的蛋白质，它扮演着对抗衰老的强大盾牌的角色。这种蛋白质主要存在于肾脏、大脑和副甲状旁腺中，有助于调节代谢、减轻炎症并保护细胞免受压力。当 Klotho 水平下降时，患年龄相关性疾病的风险就会上升，整体生存率也往往会降低。然而，在人体内测量这种蛋白质一直是一个重大挑战。Klotho 蛋白质以多种形式存在，包括全长版本和在血液中自由漂浮的可溶性版本。目前的检测方法难以区分这些不同的形式，导致结果不一致，使得难以将 Klotho 作为健康或疾病的精确标志物。

为了解决这个问题，来自乌尔姆大学及合作机构的一个研究小组开发了一种新的方法，用于检测和测量人类血液中循环的特定活性形式的 Klotho。该团队没有使用传统的抗体（抗体是由免疫系统产生的蛋白质，且难以进行一致性生产），而是转向了适配体（aptamers）。适配体是短的单链 DNA 片段，可以通过工程化手段折叠成特定的形状，从而能够高精度地附着在目标分子上，就像钥匙契合锁一样。研究人员首先创建了一个包含数十亿个随机 DNA 条带的庞大库。随后，他们将这个库置于一种被称为 FluMag-SELEX 的严格筛选过程中。在这种方法中，DNA 条带与涂有 Klotho 蛋白质的磁珠混合在一起。未能粘附的条带被洗掉，而那些与蛋白质紧密结合的则被保留下来。这个循环重复了九次，每一轮都变得更加苛刻，有效地过滤掉了弱结合剂，并使库中只富集了最有效的 DNA 序列。

这种强化筛选的结果是一个多克隆适配体库，它们表现出了识别 Klotho 蛋白质的卓越能力，特别针对一个被称为 KL1 结构域的关键部分。该结构域负责蛋白质的大部分有益活动。研究人员验证了这些 DNA 条链能够将人类 Klotho 蛋白质与类似的蛋白质区分开来，例如在小鼠中发现的一种相关版本，或者另一种被称为 beta-Klotho 的 Klotho 形式，后者并不具备相同的抗衰老功能。为了证明这些适配体在现实环境中的作用，团队在人血清中对其进行了测试，血清是含有复杂盐类、酶和其他蛋白质的人体血液液态部分。即使在这样拥挤且具有化学活性的环境中，这些适配体也能成功捕获 Klotho 蛋白质，而不被周围的生物噪声所干扰。他们证明了这些 DNA 条链保持了稳定性和有效性，能以极低的浓度与目标结合，表明其具有极高的灵敏度。

在取得成功的基础上，研究人员将这些适配体集成到一种名为石墨烯场效应晶体管的电子传感器中。这种设备使用一层石墨烯——一种由单层碳原子构成的材料——它对电环境的变化极其敏感。当传感器表面的适配体捕捉到 Klotho 分子时，石墨烯上的电荷会发生微小的偏移。通过测量这种偏移，传感器可以检测到蛋白质的存在，而无需任何荧光标记或化学标签。该设备证明能够检测广泛浓度范围内的 Kloth，从极低水平到高水平，覆盖了最低量与最高量之间一千倍的跨度。这一宽广的范围具有重要意义，因为人类的 Klotho 水平会根据年龄和健康状况而发生广泛变化。该传感器在人血清测试中仍能保持准确性，表明它能够在模拟真实临床样本的条件下可靠地量化该蛋白质。

这项研究证实，这种基于 DNA 识别与电子传感相结合的方法，为测量 Klotho 提供了一种稳定的、无需抗体的方法。与以往无法区分不同形式蛋白质的测试不同，这种新方法可以特异性地识别人类活性版本及其功能性 KL1 结构域。研究人员发现，该传感器可以在缓冲溶液中检测到低至 40.1 皮克/毫升水平的蛋白质，并且在人血清中表现一致良好。这种能力表明，该技术最终可用于监测衰老及年龄相关疾病，其精度将高于现有方法。通过提供一种清晰、特异且灵敏的方式来测量 Klotho，这项工作为更深入地理解人体如何衰老，以及这一过程未来可能受到何种影响或治疗开辟了道路。

技术摘要：一种基于 gFET 的传感器，用于针对 Klotho 定量的聚焦式 post-SELEX 适配体库

问题陈述
Klotho (KL) 蛋白是调节衰老、磷酸盐代谢和氧化应激的关键调节因子。人类循环系统中可溶性 $\alpha$ -Klotho 水平的降低与衰老、阿尔茨海默病、慢性肾脏病和糖尿病密切相关。然而，目前的检测方法（主要是酶联免疫吸附测定法，ELISA）存在显著局限性。这些方法通常无法区分不同的循环 Klotho 异构体（例如，全长 $\alpha$ -Klotho 与其功能性 KL1 结构域），也无法区分 $\beta$ -Klotho 等其他同源物。此外，ELISA 方法通常提供的动态范围有限，且在人类血清等复杂生物基质中的定量结果不一致。因此，需要一种稳定、无需抗体、具有高特异性，且能够区分 Klotho 亚型并在临床样本中实现高灵敏度定量的方法。

方法论
本研究采用了一种结合先进适配体筛选与电子生物传感的多阶段方法：

FluMag-SELEX 筛选： 研究人员利用基于荧光的磁性系统进化配体指数富集法 (Fluorescence-based Magnetic Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment, FluMag-SELEX) 生成了针对 $\alpha$ -Klotho 及其 KL1 结构域的特异性多克隆单链 DNA (ssDNA) 适配体库。
- 靶标： 固定在甲酰基活化磁珠上的 $\alpha$ -Klotho。
- 过程： 进行九轮具有递增严谨性的筛选。这包括针对未负载磁珠的反向筛选以去除非特异性结合物、增加阻断剂（BSA 和 tRNA）的浓度，以及降低适配体输入浓度。
- 监测： 通过定量 PCR (qPCR) 追踪富集程度，并通过熔解曲线分析评估结构稳定性（熔解温度， $T_m$ ）。
- 验证： 通过荧光显微镜和微孔板实验验证了对 $\alpha$ -Klotho、 $\beta$ -Klotho、小鼠 Klotho 和人血清白蛋白 (HSA) 的特异性。
适配体连接荧光分析 (ALFA)： 开发了一种“夹心”分析法，其中通过胺修饰的适配体固定在磁珠上以捕获各种基质（PBS、稀释血清、全血清）中的 Klotho。随后使用 Cy5 标记的适配体来定量捕获的靶标。这验证了该库在复杂生物流体中的稳定性和结合能力。
gFET 集成： 将选定的适配体库集成到电解质门控还原氧化石墨烯场效应晶体管 (EG-rGO-FET) 中。
- 功能化： 通过 EDC-NHS 化学反应，将 5'-胺修饰的适配体库共价耦合到芘羧基功能化的 rGO 表面。
- 检测： 该传感器以无标记方式运行。当 Klotho 与适配体功能化通道结合时，会改变局部静电环境，从而在固定的栅极电压 ( $V_G$ ) 下引起源漏电流 ( $I_{DS}$ ) 的变化。

关键结果

适配体库进化： SELEX 过程成功富集了一个具有高亲和力的多克隆库。该库的熔解温度从 SELEX 开始时的 62°C (STm) 上升到结束时的 74°C (ETm)，表明富集了具有更高 GC 含量和结构稳定性的适配体。
结合亲和力与特异性： 最终第 9 轮库表现出 $14.6 \pm 2.2$ nM 的解离常数 ( $K_d$ )。至关重要的是，该库展示了高度的特异性，能与人 $\alpha$ -Klotho 和 KL1 结构域强结合，而对 $\beta$ -Klotho、小鼠 Klotho 或 HSA 的交叉反应极小。
ALFA 性能： 夹心分析证实，适配体-磁珠系统在全人类血清中保持稳定且具有功能，能够成功捕获 Klotho，且没有明显的结合能力损失。
gFET 传感器性能：
- 动态范围： 传感器实现了 4 到 4000 pg/mL 的宽线性检测范围，覆盖了三个数量级。
- 灵敏度： 在缓冲液中测得 $\alpha$ -Klotho 的检出限 (LoD) 为 40.1 pg/mL。
- 血清中的选择性： 在人类血清中的添加实验确认，传感器在复杂生物基质中仍能保持其特异性和灵敏度，能够将 $\alpha$ -Klotho 与非靶标蛋白区分开来。
- 基质中的亲和力： 非线性回归表明，传感器在血清中对 $\alpha$ -Klotho 的亲和力（ $EC_{50} \approx 2.93$ pg/mL）与在缓冲液中相当，证实了尽管存在干扰物，结合位点仍具有可及性。

意义与主张
本文声称建立了一种稳定、无需抗体的策略，用于特异性定量 Klotho 异构体，特别是常规方法难以检测的 KL1 结构域。通过将聚焦式 post-SELEX 适配体库与石墨烯场效应晶体管相结合，作者提出了一个平台，该平台提供：

异构体区分能力： 能够区分 $\alpha$ -Klotho 与 $\beta$ -Klotho 及同源蛋白，解决了现有 ELISA 试剂盒的关键局限。
血清兼容性： 在未稀释的人类血清中表现稳健，能够实现直接临床应用，无需广泛的样本前处理。
无标记检测： 具备快速、灵敏、实时的定量能力，适用于即时检测 (point-of-care)。

作者认为，这项技术为监测循环 Klotho 水平（特别是在衰老和年龄相关疾病背景下）提供了有前景的基础，可能有助于研究 Klotho 在慢性肾脏病和代谢功能障碍等疾病中的作用。他们指出，虽然目前的研究使用的是未通过二代测序 (NGS) 分离单个适配体的多克隆库，但该库本身已足以进行即时功能化和诊断应用。

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