Combating antimicrobial resistance with lipopeptide biosurfactant produced by newly isolated Bacillus stercosis NT5 and Bacillus subtilis NT5

技术摘要：利用 Bacillus stercosis NT5 和 Bacillus subtilis NT5 的脂肽类生物表面活性剂对抗抗生素耐药性

问题陈述
全球范围内抗生素耐药性（AMR）的上升，特别是针对 ESKAPE 病原体（Enterococcus faecium、Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa 和 Enterobacter 属）的耐药性，已导致许多第一代和第二代抗生素失效。传统的抗生素通常针对 DNA/RNA 合成或特定酶，这是一种细菌可以进化出耐药性的机制。相比之下，生物表面活性剂，特别是脂肽类生物表面活性剂（LPBS），由于其具有两亲性质并能破坏细菌质膜，提供了一种潜在的替代方案——而质膜是一个不易发生快速进化适应性的靶点。虽然 Bacillus subtilis 产生 LPBS 已有充分文献记载，但对于像 Bacillus stercosis 这样的新型分离株及其针对耐药菌株的特定脂肽谱的研究仍然匮乏。

方法论
本研究分离并表征了两种新型脂肽类生物表面活性剂，分别命名为 LPA2 和 LPA3，它们分别由新分离的菌株 Bacillus stercosis NT5 和 Bacillus subtilis NT5 产生。

• 生产与提取： 使用木薯粉和芥末粕作为底物，通过固态发酵生产 LPBS。提取过程包括加水、摇晃和过滤，随后进行 80% 硫酸铵沉淀部分纯化。
• 表征： 通过以下方式确认纯化提取物为脂肽类物质：
  • 物理化学测定： 乳化指数、油位移、液滴塌陷和表面张力测量。
  • 化学分析： 利用薄层色谱法（TLC）确定 Rf 值并检测氨基酸/脂质；利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）识别官能团（C=O, N-H, C-H）。
• 抗菌评估： 使用三种互补方法测试了 LPA2 和 LPA3 对 S. aureus (MTCC3160)、P. aeruginosa (MTCC424)、E. coli (MTCC6748) 和 Paenibacillus thiaminolyticus (MTCC3088) 的活性：
  1. 肉汤稀释法： 通过测量光密度 (OD600) 来评估总生物量（活细胞、死细胞和碎片）。
  2. 基于荧光法的生存力测定： 使用碘化丙啶 (PI) 染料特异性地通过相对荧光单位 (rfu) 量化死细胞。
  3. 活菌计数平板法： 确定菌落形成单位 (cfu/ml) 以确认活细胞的减少。
• MIC 测定： 基于 12、24 和 36 小时培养期间死细胞计数 (rfu) 的持续增加来计算最小抑菌浓度 (MIC)。
• 形态学分析： 采用扫描电子显微镜 (SEM) 可视化处理前后细菌细胞膜的结构变化。

关键结果

• 表征： LPA2 和 LPA3 表现出强大的表面活性，表面张力分别为 29 mN/m 和 28 mN/m。FTIR 分析证实了肽键（酰胺）和脂肪酸链的存在，验证了其作为脂肽的身份。TLC 得到的 Rf 值分别为 0.84 (LPA2) 和 0.5 (LPA3)。
• 抗菌活性：
  • LPA2： 对革兰氏阳性菌 S. aureus 表现出最大效力。在 5.18 mg/ml 的浓度下，36 小时后达到 11,155 rfu。LPA2 对 S. aureus 的 MIC 确定为 0.647 mg/ml，36 小时培养后的 rfu 为 3,749。LPA2 对 P. aeruginosa 和 E. coli 显示出暂时或微弱的活性，对 P. thiaminolyticus 则无效。
  • LPA3： 对革兰氏阴性菌 P. aeruginosa 表现出更优越的活性，36 小时后的 MIC 为 0.323 mg/ml (rfu 为 5,812)。它也对 S. aureus 和 E. coli 具有活性，尽管对 S. aureus 的效力不如 LPA2。与 LPA2 一样，它对 P. thiaminolyticus 无效。
• 作用机制： SEM 成像显示，未经处理的细菌具有完整的膜结构。相比之下，经 LPA2 和 LPA3 处理后的细胞表现出质膜受损和明显的细胞裂解。这支持了以下假设：LPBS 通过破坏膜完整性发挥作用，这种机制不同于传统抗生素。
• 比较效力： 所获得的 MIC 值（LPA2 为 0.647 mg/ml，LPA3 为 0.323 mg/ml）被报告为显著低于此前报道的其他 LPBS 对 S. aureus 的 2 mg/ml MIC，且与某些传统抗生素（如链霉素 0.8 mg/ml）相当或更好。

意义与主张
作者声称，这项研究通过利用从 Bacillus stercosis NT5 和 Bacillus subtilis NT5 中分离出的新型脂肽类生物表面活性剂（LPA2 和 LPA3），引入了一种应对抗生素耐药性（AMR）的前所未有的方法。其主要意义在于独特的动作模式——膜裂解——这与当前抗生素的靶点不同，从而为耐药性问题提供了潜在的解决方案。研究强调，这些特定的脂肽类物质表现出高抗菌活性 (AMA)，其 MIC 值表明它们可能成为制药行业的突破口。作者得出结论，LPA2 和 LPA3 代表了能够克服 S. aureus 和 P. aeruginosa 所表现出的抗生素耐药性的潜在未来抗生素。