Dietary iron supplementation modulates jejunal epithelial lineage differentiation and enteroendocrine cell-related responses in suckling piglets

技术摘要：膳食铁补充调节仔猪空肠上皮谱系分化及肠内分泌细胞相关反应

问题陈述
铁是一种对肠道上皮稳态至关重要的必需微量元素，然而其在生命早期调节上皮谱系分化中的具体作用尚未被完全理解。尽管先前的研究已经证实铁状态会影响肠道发育、屏障功能和上皮标志物的表达，但目前尚不清楚铁的可用性是否特异性地调节不同的肠上皮谱系，特别是肠内分泌细胞（EECs）。EECs是专门的营养感应细胞，负责分泌激素和生物活性肽，在肠道成熟中发挥着至关重要的作用。此外，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）信号通路（一种已知的上皮分化和代谢适应调节因子）是否参与了铁介导的肠道反应，仍需进一步研究。

研究方法
本研究采用结合了体内动物试验、转录组学分析和体外类器官模型的多元化方法：

• 动物模型： 将24头7日龄雄性哺乳仔猪随机分为三组（每组8头）：低铁组（基础乳代品）、中铁组（基础乳代品 + 70 mg Fe/kg）和高铁组（基础乳代品 + 700 mg Fe/kg）。实验从第7天持续至第21天。
• 组织分析： 收集空肠组织进行组织学检查（通过H&E染色观察绒毛高度和隐窝深度）、定量实时荧光定量PCR（qPCR）检测上皮谱系标志物（LGR5、LYZ、MUC2、ALPI、CHGA），以及通过CHGA免疫荧光染色来量化EECs。
• 转录组学： 对低铁组和高铁组的空肠样本进行RNA-seq，以识别差异表达基因（DEGs）和富集通路。应用基因集富集分析（GSEA）专门针对PPAR信号通路进行分析。
• 类器官干预： 培养猪空肠类器官，并使用柠檬酸铁铵（FAC）模拟铁补充。为了测试PPARγ的作用，将类器官进行FAC与曲格列酮（一种PPARγ激动剂）的共同处理。分析了类器官的出芽效率和基因表达。

主要结果

1. 形态学： 膳食铁补充并未显著改变各处理组的空肠组织形态学特征（绒毛高度、隐窝深度或病理评分）。
2. 上皮谱系标志物： 铁补充上调了多种上皮谱系标志基因的表达。具体而言，高铁组显示出杯状细胞标志物 MUC2、潘氏细胞标志物 LYZ、干细胞标志物 LGR5 以及吸收性肠上皮细胞标志物 ALPI 的mRNA水平升高。
3. 肠内分泌细胞反应： 最显著且具有剂量反应效应的现象是在肠内分泌细胞标志物 CHGA 上观察到的。随着铁摄入量从低到高的增加，CHGA 的表达呈递增趋势。免疫荧光证实，与低铁组相比，高铁组的CHGA荧光强度和CHGA阳性细胞数量均显著增加。
4. 转录组图谱： 转录组分析显示，低铁组与高铁组之间存在692个差异表达基因。这些基因在PPAR信号通路中显著富集。值得注意的是，GSEA表明，在高铁组中，PPAR信号通路呈现全局性下调。
5. 类器官机制： 在猪空肠类器官中，FAC处理增加了 CHGA 的表达。然而，当通过曲格列酮激活PPARγ时，铁诱导的 CHGA 上调被显著削弱，回落至对照水平。这种效应具有特异性，因为曲格列酮并未显著改变由FAC诱导产生的 MUC2、LYZ 或 LGR5 的表达。

核心贡献

• 谱系特异性调节： 本研究证明了膳食铁的可用性可以调节仔猪空肠上皮谱系的分化，并对肠内分泌细胞相关反应（特别是 CHGA）具有优先且呈剂量依赖性的影响。
• PPARγ作为调节节点： 研究确定了PPARγ相关信号通路是铁介导的肠上皮发育的一个潜在调节节点。数据表明存在一种反向关系，即高铁抑制了PPAR信号，进而与 CHGA 表达的增加相关联。
• 通过类器官提供机制见解： 通过使用生理相关的类器官模型，本研究提供了证据，表明激活PPARγ可以选择性地抵消铁诱导的 CHGA 上调，这表明在EECs分化过程中，铁状态与PPARγ信号之间存在直接的调节相互作用。

意义
本文声称，这些发现为铁在生命早期肠上皮发育中的生物学作用提供了新的见解。具体而言，研究强调铁不仅作为一种代谢辅因子，还作为一种营养信号，重塑了上皮转录程序，特别是那些控制肠内分泌细胞的程序。本研究提出，“铁–PPARγ轴”可能是调节哺乳期内分泌细胞相关分化及功能成熟的关键机制。这些结果有助于深入理解微量元素营养如何影响新生哺乳动物的肠道屏障完整性和内分泌功能。