Integrated Multi-Omics Analysis Identifies ATAD5 as a Mediator of Tumor Plasticity and Immunosuppressive Microenvironmental Remodeling in Castration-Resistant Prostate Cancer

技术摘要：整合多组学分析确定 ATAD5 为去势抵抗性前列腺癌中肿瘤可塑性与免疫抑制微环境重构的候选标志物

问题陈述

去势抵抗性前列腺癌（CRPC）代表了该疾病的一个致命阶段，其治疗选择有限，受分子异质性、雄受体（AR）改变以及 AR 低水平或神经内分泌状态出现的影响。CRPC 进展的一个关键特征是肿瘤细胞的可塑性，即细胞获得类似于干细胞的、具有自我更新能力的及耐药性的转录程序。此外，CRPC 的肿瘤微环境（TME）以基质重构和免疫排斥为特征。然而，将肿瘤内在可塑性与微环境重构联系起来的具体分子标志物尚未得到完整定义。虽然 ATPase 家族 AAA 结构域包含蛋白 5（ATAD5）在 DNA 复制保真度和基因组维护中的作用已为人所知，但其在 CRPC 中的表达模式、临床相关性和功能意义尚未得到系统研究。

方法学

本研究采用了一个综合性的、多层级的分析框架，整合了大块转录组学、单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、空间转录组学、临床数据和功能实验：

1. 大块转录组分析：

   • 数据来源： 使用包含 68 例 CRPC 和 87 例局限性前列腺癌（LPCa）样本的三个 GEO 数据集（GSE32269、GSE35988、GSE80609）进行发现。使用 TCGA-PRAD、SU2C/PCF、DKFZ 和 ICGC 数据集进行独立验证。
   • 处理： 使用方差稳定转换（VST）对数据进行归一化，并通过 Harmony 包进行批次校正。
   • 网络分析： 进行加权基因共表达网络分析（WGCNA），以识别与 CRPC 状态相关的模块。根据模块成员度（MM > 0.7）和基因显著性（GS > 0.4）对枢纽基因（hub genes）进行优先级排序。
   • 干性评分： 应用干性样（SCL）关联评分系统对枢纽基因进行排名。
   • 免疫图谱： 使用 xCell 算法评估免疫和基质浸润情况。

2. 单细胞与空间转录组学：

   • scRNA-seq： 使用 Seurat 处理来自 GSE137829（6 名患者）的数据。通过拷贝数变异（CNV）推断（inferCNV）将恶性上皮细胞与正常上皮细胞区分开来。
   • 轨迹与相互作用： 利用伪时间轨迹分析和 CellChat 绘制细胞状态图，并预测恶性细胞与 TME 之间的配体-受体相互作用。
   • 空间转录组学： 分析来自 GSE308486（3 例 PDA 和 3 例非 PDA 病例）的数据，以可视化 ATAD5 与上皮及基质标志物（CD44、FAP、CD8A）的空间共定位。

3. 实验验证：

   • 临床标本： 通过免疫组化（IHC）在 10 例 LPCa 和 10 例 CRPC 石蜡包埋（FFPE）标本中验证 ATAD5、CD44、FAP 和 CD8A 的蛋白表达。
   • 功能实验： 在 C4-2 和 22Rv1 CRPC 细胞系中通过 siRNA 敲低 ATAD5。评估其对侵袭能力（Transwell 实验）和克隆形成能力（集落形成实验）的影响。通过蛋白质印迹法（Western blotting）确认蛋白水平。

主要贡献与结果

1. 鉴定出一种 CRPC 相关干性模块
WGCNA 鉴定出 MEblack 模块是与 CRPC 状态相关性最强的共表达网络（$r = 0.72$）。基因集富集分析（GSEA）显示，该模块富集在干性相关程序（如 RAMALHO_STEMNESS_UP）和 DNA 复制过程。

2. ATAD5 作为顶级排名枢纽基因
在 MEblack 模块的枢纽基因中，ATAD5 获得了最高的 SCL 关联评分（0.89），超过了其他候选基因如 PHTF2 和 DLGAP5。ATAD5 的表达在 CRPC 中较 LPCa 显著升高，并与干性调节因子 YAP1 和 ATXN1 呈强正相关。

3. 临床预后价值
在高水平的 ATAD5 表达与四个独立队列（TCGA-PRAD、SU2C/PCF、DKFZ、ICGC）的负面临床结局一致相关。具体而言，它与以下因素相关：

• 较短的无进展生存期（PFS）、疾病特异性生存期（DSS）和总生存期（OS）。
• 晚期 T 分期、淋巴结受累、更高的 Gleason 评分以及升高的 PSA 水平。

4. 与免疫抑制微环境的关联
ATAD5 高表达的肿瘤表现出独特的免疫抑制表型，其特征为：

• 细胞毒性 T 细胞特征减少。
• 癌症相关成纤维细胞（CAFs）和内皮细胞的富集增加。
• 免疫检查点基因（IDO1, CTLA4, CD274, LAG3, TIGIT）的上调。

5. 细胞定位与可塑性
单细胞分析将 ATAD5 主要定位在恶性上皮细胞中。ATAD5 高表达的恶性细胞表现出：

• 与 ATAD5 低表达细胞相比，具有更高的 SCL 评分。
• 在较晚的伪时间状态中富集，表明其具有渐进式获得干性特征的过程。
• 与 CAFs 和髓系细胞有更强的预测相互作用，表明其可能参与 TME 重构，尽管因果方向性需要直接的实验验证。

6. 组织水平与功能验证

• IHC： 证实了 CRPC 组织中的 ATAD5 蛋白水平显著高于 LPCa。
• 功能实验： 在 C4-2 和 22Rv1 细胞中通过 siRNA 介导的 ATAD5 敲低显著降低了细胞侵袭力和集落形成能力（$p < 0.05$），证明了其在维持侵袭和克隆形成能力中的作用。

意义与主张

作者得出结论，ATAD5 标志着 CRPC 中一种具有侵略性的、与可塑性相关的恶性上皮状态。研究认为 ATAD5 是一个候选标志物，标志着一种与 DNA 复制及干性相关的转录程序相关的恶性上皮状态，而这些程序与肿瘤进展及免疫抑制微环境有关。

论文强调，虽然 ATAD5 是研究侵略性 CRPC 生物学和不良预后的稳健候选生物标志物，但其在肿瘤进展中的因果作用及其具体的治疗潜力仍需进一步研究。作者明确指出了局限性，包括缺乏体内验证、缺乏回复实验，以及未进行多变量 Cox 回归以建立 ATAD5 作为独立预后因素的地位。因此，该研究将 ATAD5 定位为一个候选标志物，旨在引发进一步的机制和治疗探索，而非将其视为已确定的临床靶点或直接的重构介导因子。