🧬 生物学

Detecting chlorophylls and carotenoids utilizing a novel chromatographic method designed for HPLC-PDA-MS analyses and application to environmental and cultured algae and cyanobacteria

本文提出了一种利用 YMC C30 色谱柱及兼容流动相的新型 HPLC-PDA-MS 色谱方法，旨在增强对藻类色素的检测与结构分析，从而在多种蓝细菌和藻类中发现了异构体棘红醌对及新的叶绿素类似物。

原作者： Zacharias Smith, David E. Berthold, Katherine M. Gaffney, H. Dail Laughinghouse, Cathleen J. Hapeman

发布于 2026-11-04

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原作者： Zacharias Smith, David E. Berthold, Katherine M. Gaffney, H. Dail Laughinghouse, Cathleen J. Hapeman

原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 ⚕️ 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。阅读完整免责声明

在阳光普照的海洋、湖泊和河流中，微小的植物和细菌构成了食物网的基础。这些被称为藻类和蓝细菌的生物，依赖于一系列色彩斑斓的化学物质来捕捉阳光并将其转化为能量。其中最著名的便是叶绿素（赋予植物绿色的色素）以及类胡萝卜素（颜色从黄色到深橙色及红色不等）。科学家长期以来一直研究这些色素，以了解水体中存在多少生命，追踪生态系统的健康状况，并监测可能污染水源的有毒藻类爆发。几十年来，测量这些化学物质的标准方法是一种称为高效液相色谱的技术，它将混合物分离成各个组成部分，随后使用一种仅测量化学物质吸收多少光线的基于光的检测器。虽然这种方法对于已知物质效果良好，但在面对自然水样中复杂且多变的变化时却显得力不从心，往往会遗漏细微的变化，或将外观相似的分子混淆。

现在，一组研究人员开发出了一种观察这些色素的新方法，通过将分离技术与一种能够称量单个分子的更强大的检测器相结合，克服了这些局限性。通过重新设计色素在机器中经历的化学旅程，他们创造出一种可以同时识别数十种不同化合物的方法，包括一些从未被发现过的化合物。这种方法让科学家不仅能看到绿色和橙色的宏观类别，还能看到居住在水中的生物的具体分子指纹。其结果是提供了一幅更清晰的图景，展示了谁生活在湖泊或海洋中，它们如何适应环境，以及它们可能隐藏着哪些新的化学秘密。

研究人员首先解决了分析这些色素时的一个基本问题。传统方法通常使用化学添加剂来帮助分离色素，但这些添加剂会对用于称量分子的敏感检测器产生毒性。为了解决这个问题，团队构建了一个新系统，使用一种装有特制微珠的专用柱，旨在根据色素的形状和大小进行捕获与分离。他们将此与甲醇和乙酸乙酯等温和的溶剂流相结合，这些溶剂对环境更安全，且与先进的检测器兼容。这种设置使他们能够以以前难以实现的精度分离广泛的叶绿素和类胡萝卜素，特别是针对那些此前难以与其它类型藻类区分开来的特定类型叶绿素。

当他们将这种新方法应用于野外样本进行测试时，结果令人震惊。在一个采集自佛罗里达海港的绿色藻类——海藻（Caiferpa）样本中，机器揭示了一种复杂的混合物，其中包括几种与任何已知参考物质都不匹配的色素。研究人员鉴定出了看似是新型叶绿素的物质，这些分子看起来像标准的叶绿素，但重量略有不同，这表明它们可能是由藻类制造的改良版本。同样，在一种名为拟蓝细菌（Planktothricoides）的蓝细菌菌株中，他们发现了一组独特的色素，其中包括这些新型叶绿素，但完全缺乏一种通常存在于此类细菌中的常见橙色色素——棘赤红素（echinenone）。这种缺失意义重大，因为棘赤红素在这些生物管理光照方面起着关键作用，而其在健康培养物中的完全缺失暗示了一种独特的生物策略。

一个最令人惊讶的发现来自于对棘赤红素这一色素的深入观察，科学家们长期以来一直认为它是一种单一、简单的化合物。然而，新方法显示，过去被认为是一种物质的东西，实际上是一对非常相似的分子，就像彼此的镜像一样，在之前的研究中一直隐藏在一起。研究人员发现，不同的蓝细菌菌株产生的这两种形式的比例不同，且两者之间的平衡可能会发生显著变化。这一发现表明，这些生物处理光照和压力的方式可能比之前理解的更为复杂，因为这两种形式的色素可能在细胞内承担不同的功能。该方法还揭示了其他常见色素（如来自五大湖区丝状绿藻 Cladophora 中的色素）存在着许多此前无法区分的不同形式。

这种新方法的强大之处在于其“洞察无形”的能力。通过在分子经过检测器时对其进行称重，研究人员可以分辨出那些在旧的光学检测器看来完全相同的物质。这使他们能够发现以前无法观测到的痕量色素，并确认看似单一的颜色峰值实际上是一群不同的分子。他们将该技术应用于休伦湖和密歇根湖的样本，发现虽然主要色素保持一致，但辅助色素的具体组合在不同地点各不相同。这种差异暗示了局部环境或特定藻类与细菌类型的细微差别，从而提供了一种有助于改进卫星监测水质质量水平的细节。

该研究还表明，这种方法在不需要昂贵质谱仪的情况下也能很好地运行，这意味着它可以用于仅配备标准光学检测器的实验室。然而，增加称重检测器提供了一层此前无法实现的确定性，使得识别新分子并高置信度地确认已知分子成为可能。研究人员指出，虽然该方法灵敏度极高，但需要仔细处理以确保结果准确，且机器对不同样本反应的轻微变化是可控的。最终，这项工作为更深入地理解微观世界打开了大门，揭示了藻类和蓝细菌的化学多样性比标准教科书所描述的要丰富和多样得多。通过提供观察这些微小生物的清晰视角，该方法为探索我们水道的健康状况以及生命本身复杂的化学过程提供了新的工具。

技术摘要：利用新型色谱法进行 HPLC-PDA-MS 分析以检测叶绿素和类胡萝卜素

问题陈述
叶绿素和类胡萝卜素分析是水产养殖、淡水与海洋研究以及生态多样性评估的基础。历史上，这些分析依赖于结合高效液相色谱（HPLC）的光度检测（PDA 或荧光）。虽然对于许多应用而言这些方法是有效的，但它们也面临着显著的局限性：

与质谱（MS）的不兼容性： 既有的色谱方法，特别是基于海洋研究科学委员会（SCOR）框架的方法，使用含有高盐浓度和离子对试剂（如四丁基铵乙酸盐）的流动相来实现分离。这些添加剂与电喷雾电离（ESI）质谱不兼容，因此必须重新设计分离系统才能实现 MS 检测。
异构体分辨率： 天然色素混合物包含许多难以分离的异构体（立体异构和构造异构）。缺乏高分辨率分离会导致定量不准确，并可能遗漏新化合物。
结构信息有限： 光度检测器提供的结构数据有限，使得难以区分共流出的异构体，或在没有参考标准的情况下识别未知色素。
技术停滞： 尽管柱技术（如 C30 相）和 MS 已取得进展，但用于结合叶绿素/类胡萝卜素分析的核心分析方法在过去十年中基本没有发生根本性变化，通常仍局限于特定的目标分析物，或缺乏 MS 兼容性。

方法论
作者开发了一种新型色谱方法，旨在不使用离子对试剂分离广泛的藻类色素（叶绿素和类胡萝卜素），该方法使用了 YMC C30 “类胡萝卜素柱”（3.0 x 250 mm, 3 nm）。

流动相： 该系统使用由以下组分组成的三元梯度：
- 溶剂 A：含有高浓度氨水和甲酸的甲醇（MS 兼容的添加剂）。
- 溶剂 B：乙酸乙酯。
- 溶剂 C：水。
- 梯度在整个运行过程中保持恒定的 5% 水含量，并在 15–30 分钟之间包含一个等度保持阶段（A:B:C = 65:30:5），以优化 c-叶绿素和其他关键分析物的分离。
检测： 该方法兼容单独的二极管阵列（PDA）检测，以及 PDA 与三重四极杆质谱（MS/MS）联用。
- PDA： 数据采集范围为 350–700 nm。使用特定波长（例如用于叶绿素的 665 nm 和用于类胡萝卜素的 450 nm）来分离分析物类别。
- MS： 在高分辨率扫描模式（400–950 m/z）下运行，以检测分子离子（ $M^+$ 或 $[M+H]^+$ ）和同位素模式。这允许识别缺乏商业标准的化合物，并根据质荷比解析共流出的异构体。
样品制备： 环境和培养样本（如 Caulerpa、Microcystis、Cladophora）使用 90% 丙酮进行提取、超声处理并过滤。该方法通过认证参考物质进行了验证，并应用于多种蓝细菌菌株及来自五大湖的环境样本。

主要贡献与结果

c-叶绿素的基线分离： 该方法实现了叶绿素 $c_1$ 、 $c_2$ 和 $c_3$ 的基线分离，这是文献中持续数十年的挑战。与以往方法中这些化合物较早流出且分辨率较差不同，C30 柱配合该溶剂系统使其保留能力增强，这可能是由于色素的羧酸基团与固定相的未封端硅醇基团之间的相互作用所致。
红海胆黄素（Echinenone）异构体的发现： 研究表明，“红海胆黄素”（echinenone，CAS 432-68-8）并非单一化合物，而是一对差向异构体。此外，研究还发现 3-OH 红海胆黄素也是一对异构体。这些发现同时出现在培养的蓝细菌和环境样本中，暗示了其对蓝细菌光合作用及橙色类胡萝卜素蛋白复合物的影响。
新型叶绿素类似物的鉴定： 该方法检测到了在 Caulerpa 和 Planktothricoides sp. BLCC-F182 中存在的推测新型叶绿素。这些化合物似乎是叶绿素 $b$ 的羟基化或脱羟基化衍生物（分子量分别为 ~926 和 ~892 AMU）。Planktothricoides sp. BLCC-F182 的独特之处在于，它在产生这些新型叶绿素的同时完全缺乏红海胆黄素。
增强的灵敏度与特异性： MS 检测提供的检出限（LODs）比 PDA 检测低 10–100 倍。MS 能够区分共流出的色素（例如区分叶黄素与玉米黄质，或识别岩藻黄素的痕量异构体），而这些在 PDA 下是无法区分的。
复杂混合物的应用： 该方法成功解析了包括五大湖 Caulerpa 和 Cladophora 在内的复杂环境样本中的数十种色素。它揭示了不同菌株和地点之间显著的色素谱差异，包括在 Cladophora 藻华中发现了 PDA 无法检测到的痕量蓝细菌标记物（红海胆黄素）。
绿色化学： 该方法使用乙酸乙酯取代了 C30 分离中常用的有毒溶剂甲基叔丁基醚（MTBE），后者毒性更高且对环境不利。

意义与主张
作者声称，该方法论通过弥合传统光度法与现代质谱法之间的鸿沟，代表了藻类色素分析领域的重大进步。

多功能性： 该系统设计为可以有效地在配备或不配备 MS 检测器的条件下运行，这使得仅具备 PDA 能力的实验室也能使用，同时为拥有 MS 能力的实验室提供了更优的分辨率。
发现潜力： 通过实现异构体的分离以及通过质谱数据检测未知物，该方法为发现藻类和蓝细菌中的新型色素多样性打开了大门，超越了当前研究中所谓的“已解决”状态。
生态相关性： 精确剖析复杂色素混合物（包括痕量异构体和新型类似物）的能力，为生态评估、遥感地面实况校验以及理解自然环境中光合机制的多样性提供了更稳健的数据。
方法论的灵活性： 作者指出，该方法框架具有灵活性，允许在保持相似色谱结果的前提下调整进样量、梯度和 HPLC 制造商，从而促进广泛采用。

文章总结道，虽然本研究涵盖的样本集有限，但新型叶绿素的发现和异构体对的解析表明，叶绿素领域远未被完全探索，而这种 HPLC-PDA-MS 方法为未来的研究提供了一个强大的工具。

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