Direct whole-plastome alignment systematically inflates long-branch artifacts in chloroplast phylogenomics: a 468-paper audit and three-method reanalysis
对468篇叶绿体系统发育基因组学论文进行的全面审计表明，直接进行全质体组多序列比对会因为未处理倒置重复序列和基因重排等结构复杂性，而系统性地夸大长枝吸引效应，因此必须采用感知结构的比对策略以确保系统发育的准确性。
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植物的叶绿体内携带了一个微小的、自给自足的遗传指令库，这些绿色细胞器负责将阳光转化为食物。几十年来，科学家们一直利用这些“图书馆”来追踪植物界的家族树，弄清哪些物种亲缘关系较近，哪些是远亲。这种方法的标准做法是从这个库中提取特定且稳定的部分进行遗传编码，将它们与其它植物的相同部分并排排列，并通过寻找差异来绘制其历史图谱。这种方法之所以有效，是因为它将遗传代码视为一系列独立的章节，从而确保比较过程公平且准确。然而，完整的遗传库结构非常复杂，其中的某些部分在不同物种之间可能会发生翻转、交换或长度变化。当研究人员试图一次性对整个遗传库进行比对，而不是仅针对那些稳定的章节时，他们面临着强行将不匹配的部分凑在一起的风险，从而产生关于植物亲缘关系的错误图景。
由东华大学的徐志杰（Zhi-Jie Xu）开展的一项近期研究调查了这种通过比对整个遗传库来走捷径的做法引发错误的频率。研究人员审查了 2023 年底至 2026 年底发表的 468 篇使用叶绿体基因组构建植物家族树的科学论文。其目标是观察这种比对全基因组的普遍做法是否正在系统性地产生误导性结果，特别是让某些植物分支看起来在演化距离上异常长，从而显得与亲属关系疏远。通过使用三种更严谨的方法对最可疑的案例进行重新分析，研究发现这种捷径确实带来了问题。在所审查的论文中，约有 7.7% 的案例中，原本在原始发表的树状图中出现的那些长而奇怪的分支，在采用更严格的技术进行数据分析后消失了，或者变得短了很多。这表明，对于相当数量的近期研究而言，家族树的扭曲并非源于植物本身的生物学特性，而是源于遗传数据比对的方式。
问题的根源在于叶绿体基因组的物理特性。它被组织成四个部分，其中两个大段是彼此镜像的，还有一个小段可以改变其方向。当科学家从短的 DNA 片段组装基因组时，计算机往往无法判断这个小段的方向。如果研究人员在没有检查这种方向性的情况下，尝试将一个植物的整个基因组与另一个进行比对，计算机可能会强行让翻转的部分去匹配未翻转的部分。这会产生大量的伪造缺口和不匹配。计算机将这些被迫产生的错配解释为巨大的进化变化，进而使该植物所属的分支看起来比实际情况要长得多。这种被称为“长枝吸引”（long-branch attraction）的现象，可能会误导计算机将该植物放置在家族树的错误位置，仅仅因为它们共同拥有这种比对错误，就将其与不相关的物种归为一类。
为了测试这一问题的普遍程度，研究人员审计了一本发表大量植物基因组研究论文的期刊。在 468 篇论文中，有 53 篇被标记为具有可疑的长枝或奇怪的树状结构。随后，研究人员使用三种独立的策略对这些候选案例进行了重新分析。第一种策略模拟了原论文中常用的工作流程，即直接比对整个基因组。第二种策略将基因组分解为尊重 DNA 自然结构的微小局部匹配块，并忽略掉那些发生重排的部分。第三种策略则专注于在所有研究植物中都存在的单拷贝基因，从而避开那些混乱且多变的区域。结果非常明确：在 53 个案例中，有 36 个案例在第一种方法下重现了原始的长枝，但在使用第二和第三种方法时，这些长枝消失或显著缩短。这证实了原始的树状图很可能是由于比对过程产生的伪影，而非真实的生物信号。
研究还深入探讨了这些错误的物理成因。通过将问题植物的 DNA 序列与正常植物进行对比，研究人员发现绝大多数错误都与特定的结构问题有关。在 17 个案例中，基因组的小段方向被翻转到了错误的方向，导致比对软件无法处理；在另外 16 个案例中，基因组经历了更复杂的重排，导致基因顺序被打乱；只有 2 个案例是由于镜像部分的扩张引起的。这种结构性的诊断证实，这些错误并非随机发生的，而是直接与 DNA 的组织方式以及研究人员选择的比对方式相关。研究指出，在 2023 年，这类错误的发生率明显较高，约为 20%，但在随后的几年中降至约 6.7%，这表明科研界可能正逐渐意识到这一问题，尽管它仍然是一个持续存在的问题。
该审计的一个关键发现是研究报告中缺乏透明度。虽然所有 36 篇确认存在错误的论文都附带了补充文件，但没有一篇包含实际的计算机可读数据文件（例如比对矩阵或构建树的具体规则）。如果没有这些文件，其他科学家就无法检查工作或重复分析以验证结果。研究人员认为，这是阻碍科学进步的一个主要障碍。分享这些文件的技术已经存在，要求提供这些文件也并不困难。通过公开原始数据和比对规则，期刊可以确保其发表的家族树是稳健且可重复的。研究结论指出，虽然直接进行全基因组比对是一种诱人的捷径，但它并非中立的；它会系统性地夸大进化距离的外观，并可能导致关于植物亲缘关系的错误结论。为了避免这些陷阱，研究人员被建议提取特定基因，或使用能够尊重叶绿体基因组独特结构的“结构感知型”工具，并且在构建树之前务必检查是否存在结构翻转。
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