Integrated single-cell and bulk transcriptomes identify glycosylation-associated prognostic markers for anti-PD-1 response in liver cancer

技术摘要：整合单细胞与大块转录组学鉴定肝癌抗 PD-1 反应相关的糖基化相关预后标志物

问题陈述
肝细胞癌（HCC）仍是导致癌症死亡的主要原因，许多病例在诊断时已处于晚期，治疗选择有限。虽然免疫检查点阻断（抗 PD-1 疗法）改善了一部分患者的预后，但对 PD-1 阻断的初级耐药和获得性耐药仍然是重要的临床障碍。将糖基化失调（一种已知会影响蛋白质功能和肿瘤进展的过程）与肝癌抗 PD-1 耐药性联系起来的分子机制尚未得到充分定义。本研究旨在鉴定作为预后标志物的糖基化相关基因（GRGs），并阐明它们与肿瘤免疫微环境及抗 PD-1 反应之间的关系。

研究方法
本研究采用了结合单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和 bulk RNA-seq 数据（大块转录组测序）的整合多组学方法：

1. 数据获取： 从 TCGA-LIHC 队列（377 例肿瘤样本，59 例正常样本）和三个 GEO 数据集（GSE202069：包含响应者/非响应者的抗 PD-1 治疗 bulk RNA-seq；GSE43619：包含生存数据的 bulk RNA-seq；以及 GSE149614：来自 10 例 LIHC 患者的 scRNA-seq）中获取转录组谱。从 MSigDB 中提取了由 675 个糖基化相关基因（GRGs）组成的精选列表。
2. 单细胞分析与细胞亚群鉴定：
   • 使用 Seurat 对 scRNA-seq 数据（GSE149614）进行质量控制、降维（PCA、UMAP）和聚类处理。
   • Scissor 分析： 利用 Scissor 包将 GSE149614 的单细胞图谱与 GSE202069 bulk 队列中的临床反应数据相联系，以鉴定与抗 PD-1 反应特异性相关的细胞亚群。
   • 关键细胞鉴定： T 细胞和自然杀伤（T/NK）细胞被确定为关键的反应相关亚群，其中“循环 T 细胞”（Cycling T cells）显示出最强的正向信号。
3. 候选基因筛选：
   • 在 scRNA-seq 数据中鉴定 T/NK 细胞与其他细胞之间的差异表达基因（DEGs）。
   • 在 TCGA 中的 LIHC 与正常组织之间筛选 bulk-DEGs。
   • 交集分析： 候选基因定义为 GRGs、T/NK 细胞 DEGs 和 bulk-DEGs 的交集，最终得出 20 个候选基因。
4. 预后模型构建：
   • 应用单变量 Cox 回归和 LASSO 回归对 TCGA-LIHC 训练队列进行分析，以筛选生存相关的 GRGs。
   • 构建了一个包含两个基因的风险特征模型（TUBA3C 和 HGFAC）。根据最佳截断值将患者分为高风险（HR）组和低风险（LR）组。
   • 在 GSE43619 队列中验证了该模型，并使用包含风险评分和病理 M 分期的 Kaplan-Meier 生存曲线、ROC 分析和临床列线图进行评估。
5. 功能与机制分析：
   • 富集分析： 进行基因集富集分析（GSEA）和通路分析（GO/KEB），以识别与风险组相关的生物学通路。
   • 免疫浸润： 使用 CIBERSORT 估算免疫细胞丰度，并将其与风险评分和 GRG 表达量进行关联。
   • 药物敏感性： 使用 GDSC 数据库分析和 oncoPredict 来预测 HR 组和 LR 组之间的药物敏感性（IC50）差异。
   • 虚拟敲除与拟时序分析： 使用 scTenifoldKnk 模拟基因敲除以推断调节网络，并使用 Monocle3 进行拟时序分析，以追踪 T/NK 细胞分化过程中 GRG 的表达动态。
   • 药物发现： 利用 GraphBAN 预测与预后 GRGs 相互作用的小分子，随后进行 ADMET 过滤、分子对接和分子动力学模拟。
6. 实验验证：
   • 通过人类蛋白质图谱（HPA）验证蛋白质表达。
   • 在二乙基硝胺（DEN）诱导的小鼠模型中，通过 RT-qPCR 验证了 LIHC 肿瘤组织与相邻非肿瘤组织中 TUBA3C 和 HGFAC 的 mRNA 表达。

主要结果

• 关键细胞亚群： Scissor 分析确定循环 T 细胞是驱动抗 PD-1 反应的关键亚群。细胞间通讯分析显示，循环 T 细胞与 CD4+ 辅助/调节 T 细胞之间存在活跃的相互作用，这种作用由 MIF 和 MDK 等配体介导。
• 预后特征： 交集分析产生了 20 个候选基因。LASSO 回归将此精炼为两个基因的特征模型：TUBA3C（风险相关，HR > 1）和 HGFAC（保护相关，HR < 1）。
• 模型性能： 风险模型在 TCGA 和 GSE43619 队列中均成功实现了患者分层。HR 组的总生存期（OS）显著缩短。该模型在 1 年、3 年和 5 年生存率方面的 AUC 分别达到 0.66、0.61 和 0.66。结合风险评分和病理 M 分期的列线图在决策曲线分析（DCA）中展示了良好的临床实用性。
• 生物学机制：
  • 通路： HR 组与 BMP 信号通路、凝血级联反应和补体级联反应相关。
  • 免疫景观：： HR 组表现出静息记忆 CD4+ T 细胞和单核细胞的浸润增加，而 LR 组则具有较高比例的 M0 巨噬细胞、滤泡辅助 T 细胞和激活的树突状细胞。HGFAC 的表达与单核细胞呈正相关，与 M0 巨噬细胞呈负相关。
  • 分化： 拟时序分析表明，TUBA3C 的表达在 T/NK 分化的中后期达到顶峰，而 HGFAC 在后期保持高水平。
• 治疗意义：
  • 药物敏感性： 预测 HR 组对 Wee1 抑制剂（MK-1775、Tozasertib）、WEHI-539 和 Bortezomib 更敏感。LR 组对 Nutlin 和 Selumetinib 表现出更高的敏感性。
  • 药物发现： GraphBAN 和对接模拟鉴定出 1,2-O-(1-Methylethylidene)-α-L-ribofuranose 为候选分子，该分子与 TUBA3C 具有稳定的结合力（结合能 -5.8 kcal/mol）并具有良好的 ADMET 特性。
• 验证： RT-qPCR 证实了 TUBA3C 在 LIHC 组织中表达上调，而 HGFAC 在 LIHC 组织中表达下调，这与计算预测一致。

意义与主张
作者声称，本研究为肝癌的个体化风险评估和治疗分层提供了一个潜在的框架。通过整合单细胞和 bulk 转录组学，本研究鉴定了与抗 PD-1 反应相关的糖基化相关预后标志物 TUBA3C 和 HGFAC。研究结果表明，这些基因提供了关于 LIHC 进展的机制见解，特别是涉及糖基化、免疫细胞浸润（特别是单核细胞和巨噬细胞）以及 BMP 等信号通路之间的相互作用。

论文谨慎地总结道，尽管该双基因模型显示出强大的预后能力，并与免疫景观及药物敏感性建立了联系，但在临床应用前，仍需在更大的免疫治疗队列和实验模型中进行进一步验证。该研究并非声称解决了抗 PD-1 耐药性问题，而是为将这些基因作为治疗靶点和诊断生物标志物提供了基础。