A Matrix-Tolerant In-Situ Derivatization Strategy for Trace-Level UPLC-MS Quantification of the Carcinogen Impurity 2-Ethylphenylhydrazine in Etodolac Drug Substance

في عالم الأدوية، تعتبر الرحلة من تفاعل كيميائي في المختبر إلى حبة دواء على الرف مساراً معبداً بفحوصات سلامة صارمة. وتتمثل إحدى العقبات الأكثر حرجاً في رصد كميات ضئيلة من النواتج الثانوية غير المرغوب فيها، والمعروفة باسم الشوائب، التي قد تتكون أثناء عملية التصنيع. وبعض هذه الشوائب ليست مجرد بقايا غير ضارة؛ بل يمكن أن تكون جينية سامة، مما يعني أن لديها القدرة على إتلاف الحمض النووي والتسبب في السرطان. ولأن جسم الإنسان حساس للغاية تجاه هذه التهديدات، يفرض المنظمون ضرورة الكشف عن حتى أصغر كميات من هذه المواد والتحكم فيها. ويكمن التحدي في حقيقة أن هذه الجزيئات الخطيرة غالباً ما تكون غير مستقرة، وتفاعلية، وموجودة بكميات ضئيلة جداً لدرجة أنها تكاد تكون غير مرئية لأجهزة الاختبار القياسية. ولإيجادها، يتعين على العلماء غالباً استخدام حيل كيميائية ذكية لجعل غير المرئي مرئياً، عبر تحويل الجزيء غير المستقر إلى شكل مستقر وقابل للكشف دون فقدان تتبع مقدار ما كان موجوداً في الأصل.

هذه هي المشكلة الدقيقة التي سعى فريق من الباحثين في شركة "أولكار كيميا" (Ulkar Kimya) في تركيا لحلها فيما يتعلق بدواء محدد يسمى "إيتودولاك" (Etodolac). الإيتودولاك هو مسكن للآلام ومضاد للالتهابات يستخدم على نطاق واسع. وأثناء عملية إنتاجه، يُستخدم مركب كيميائي يسمى "2-إيثيل فينيل هيدرازين" (2-Ethylphenylhydrazine) كحجر بناء. وبينما يعد هذا الكيميائي ضرورياً لصنع الدواء، فإنه أيضاً مادة معروفة بأنها مسرطنة، مما يعني أنه يمكن أن يسبب السرطان. وإذا بقيت حتى كمية ضئيلة جداً من هذه المادة الأولية في الدواء النهائي، فإنها تشكل خطراً صحياً جسيماً. احتاج الباحثون إلى طريقة لقياس هذه الشائبة بدقة متناهية، تصل إلى بضعة أجزاء في المليار، لضمان سلامة الدواء للمرضى. ومع ذلك، واجهوا عقبة كبيرة: فمركب "2-إيثيل فينيل هيدرازين" غير مستقر كيميائياً ويتفاعل بشكل سيئ مع الآلات المستخدمة للكشف عنه، مما يجعل من المستحيل تقريباً قياسه مباشرة في الخليط المعقد للدواء النهائي.

اكتشف الفريق أن محاولة قياس الشائبة مباشرة كانت تشبه محاولة وزن شبح؛ فالجزيء كان عابراً جداً وهادئاً جداً بحيث لا تستطيع الأجهزة التقاطه. ولحل هذه المشكلة، طوروا استراتيجية لتحويل الشائبة كيميائياً إلى جزيء مختلف وأكثر استقراراً داخل أنبوب الاختبار مباشرة قبل التحليل. قاموا بخلط عينة الدواء مع مادة كيميائية محددة تسمى "2-هيدروكسي بنزالدهيد" (2-hydroxybenzaldehyde). يعمل هذا الكاشف مثل مشبك جزيئي، حيث يلتصق بالشائبة غير المستقرة ويحبسها في هيكل جديد متين يسمى "هيدرازون" (hydrazone). هذا الهيكل الجديد يسهل على الآلة رؤيته وقياسه بكثير. ومع ذلك، وجد الباحثون سريعاً أن خطوة الخلط البسيطة هذه فشلت عند وجود عينة الدواء. فقد تداخلت الحموضة الطبيعية لدواء "الإيتودولاك" نفسه مع التفاعل، مما تسبب في تفكك الجزيء الجديد المستقر قبل أن يتمكنوا من قياسه.

للتغلب على هذا التداخل، قام العلماء بتعديل بيئة التفاعل. فقد أضافوا مادة قاعدية، وهي الأمونيا، إلى الخليط. عملت هذه الخطوة على تحييد حموضة الدواء، مما خلق بيئة هادئة ومتوازنة حيث يمكن للتحول الكيميائي أن يمضي قدماً دون انقطاع. ثم قاموا بتسخين الخليط إلى خمسين درجة مئوية وتركوه لمدة ستين دقيقة. وتحت هذه الظروف المحددة، كان التحول شبه كامل، حيث تم تحويل تسعة وتسعين فاصلة تسعة بالمائة من الشائبة غير المستقرة بنجاح إلى الشكل المستقر القابل للكشف. سمحت لهم هذه الاستراتيجية "في الموقع" (in-situ)، والتي تعني إجراء العمل الكيميائي مباشرة داخل العينة، بتجاوز عدم استقرار الجزيء الأصلي وتداخل مصفوفة الدواء.

بعد إتقان التحول الكيميائي، انتقل الفريق إلى مرحلة الكشف. استخدموا جهازاً متطوراً يسمى "UPLC-MS"، والذي يجمع بين فاصل سائل عالي السرعة ومطياف كتلة. يعمل الفاصل السائل مثل مرشح عالي الدقة، حيث يصنف الجزيئات بناءً على كيفية حركتها عبر أنبوب، بينما يعمل مطياف الكتلة كميزان شديد الحساسية لوزن الجزيئات وتحديد هويتها. قام الباحثون بضبط الجهاز للبحث تحديداً عن وزن جزيء "الهيدرازون" الجديد الذي كونوه. ووجدوا أن الطريقة يمكنها اكتشاف الشائبة بمستويات منخفضة للغاية، بحد كشف يصل إلى صفر فاصلة صفر ستة ثمانية خمسة ثمانية نانوغرام لكل ميلي لتر. وهذه الحساسية أقل بكثير من حد السلامة الذي وضعته الإرشادات الدولية، والتي تسمح بحد أقصى قدره جزء واحد ونصف من المليون من الشائبة في الدواء.

ثم اختبر الباحثون طريقتهم الجديدة بصرامة لضمان كونها موثوقة ودقيقة ومتسقة. تحققوا مما إذا كان بإمكان الجهاز التمييز بين الشائبة والدواء نفسه، وقد فعل ذلك دون أي ارتباك. كما اختبروا مدى قدرة الطريقة على قياس كميات مختلفة من الشائبة، ووجدوا خطاً مستقيماً يمكن التنبؤ به من أدنى كمية قابلة للكشف وصولاً إلى التركيزات الأعلى. كما تحققوا أيضاً مما إذا كانت النتائج ستتغير إذا قام أشخاص مختلفون بإجراء الاختبار أو إذا تغيرت درجة الحرارة قليلاً، وصمدت الطريقة تحت كل هذه الظروف. وأكد الفريق أن الشكل الكيميائي الجديد للشائبة ظل مستقراً في المحلول لمدة ثماني ساعات على الأقل، مما منحهم وقتاً كافياً لإجراء الاختبارات دون أن تتحلل العينة.

أخيراً، طبق الفريق طريقتهم الجديدة على عشر دفعات مختلفة من "الإيتودولاك" تم إنتاجها في منشأتهم. قاموا بتحليل كل دفعة بعناية، بحثاً عن أي علامة على الشائبة الخطيرة. وكانت النتيجة واضحة: لم يتم اكتشاف الشائبة في أي من الدفعات العشر. لم يعني هذا أن الطريقة معطلة؛ بل على العكس، أثبتت الاختبارات السابقة بإضافة شوائب أن الطريقة حساسة بما يكفي للعثور عليها إذا كانت موجودة. إن غياب الإشارة في دفعات الإنتاج يعني أن عملية التصنيع نجحت في إبقاء مستويات الشائبة تحت حد الكشف، مما يضمن سلامة الدواء. يوفر هذا العمل أداة قوية وعملية لمراقبة الجودة، مما يسمح للمصنعين بمراقبة وضمان سلامة "الإيتودولاك" بمستوى من الثقة كان من الصعب تحقيقه سابقاً.