A Matrix-Tolerant In-Situ Derivatization Strategy for Trace-Level UPLC-MS Quantification of the Carcinogen Impurity 2-Ethylphenylhydrazine in Etodolac Drug Substance

फार्मास्युटिकल्स की दुनिया में, प्रयोगशाला में एक रासायनिक अभिक्रिया से लेकर शेल्फ पर रखी एक गोली तक का सफर कठोर सुरक्षा जांचों से बना एक मार्ग है। सबसे महत्वपूर्ण बाधाओं में से एक उन अवांछित उपोत्पादों (byproducts) के सूक्ष्म अंशों को पहचानना है, जिन्हें अशुद्धियाँ (impurities) कहा जाता है, जो निर्माण प्रक्रिया के दौरान बन सकते हैं। इनमें से कुछ अशुद्धियाँ केवल हानिरहित अवशेष नहीं हैं; वे जेनोटॉक्सिक (genotoxic) हो सकती हैं, जिसका अर्थ है कि उनमें डीएनए को नुकसान पहुँचाने और कैंसर का कारण बनने की क्षमता होती है। क्योंकि मानव शरीर इन खतरों के प्रति बहुत संवेदनशील है, इसलिए नियामक यह मांग करते हैं कि ऐसी वस्तुओं की अत्यंत सूक्ष्म मात्रा का भी पता लगाया जाए और उन्हें नियंत्रित किया जाए। चुनौती इस तथ्य में निहित है कि ये खतरनाक अणु अक्सर अस्थिर, प्रतिक्रियाशील होते हैं और इतनी कम मात्रा में मौजूद होते हैं कि वे मानक परीक्षण उपकरणों के लिए लगभग अदृश्य होते हैं। उन्हें खोजने के लिए, वैज्ञानिकों को अक्सर अदृश्य को दृश्य बनाने के लिए चतुर रासायनिक युक्तियों का उपयोग करना पड़ता है, जिससे अस्थable अणु को एक स्थिर, पता लगाने योग्य रूप में बदला जा सके, बिना इस बात का पता खोए कि मूल रूप से वहां कितना था।

यही वह सटीक समस्या है जिसे तुर्की में उलर किम्या (Ulkar Kimya) के शोधकर्ताओं की एक टीम ने एटोडोलैक (Etodolac) नामक एक विशिष्ट दवा के संबंध में हल करने का प्रयास किया। एटोडोलैक एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली दर्द निवारक और सूजनरोधी दवा है। इसके निर्माण के दौरान, 2-एथिलफेनिलहाइड्राज़ीन (2-Ethylphenylhydrazine) नामक एक रसायन एक बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में उपयोग किया जाता है। हालांकि यह रसायन दवा बनाने के लिए आवश्यक है, लेकिन यह एक ज्ञात कार्सिनोजेन (carcinogen) भी है, जिसका अर्थ है कि यह कैंसर का कारण बन सकता है। यदि इस शुरुआती सामग्री काแม้ एक छोटा सा हिस्सा भी अंतिम दवा में रह जाता है, तो यह गंभीर स्वास्थ्य जोखिम पैदा करता है। शोधकर्ताओं को इस अशुद्धि को अत्यधिक सटीकता के साथ मापने के तरीके की आवश्यकता थी, जो कुछ पार्ट्स प्रति बिलियन (parts per billion) तक हो, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि दवा मरीजों के लिए सुरक्षित है। हालांकि, उन्हें एक महत्वपूर्ण बाधा का सामना करना पड़ा: 2-एथिलफेनिलहाइड्राज़ीन रासायनिक रूप से अस्थिर है और उन मशीनों के साथ खराब प्रतिक्रिया करता है जिनका उपयोग इसे पता लगाने के लिए किया जाता है, जिससे इसे तैयार दवा के जटिल मिश्रण में सीधे मापना लगभग असंभव हो जाता है।

टीम ने पाया कि अशुद्धि को सीधे मापने की कोशिश करना एक भूत को तौलने की कोशिश करने जैसा था; अणु बहुत क्षणभंगुर और बहुत शांत था कि उपकरण उसे पकड़ सकें। इसे हल करने के लिए, उन्होंने विश्लेषण से ठीक पहले टेस्ट ट्यूब के अंदर ही अशुद्धि को एक अलग, अधिक स्थिर अणु में बदलने की एक रणनीति विकसित की। उन्होंने दवा के नमूने को 2-हाइड्रॉक्सीबेंजाल्डिहाइड (2-hydroxybenzaldehyde) नामक एक विशिष्ट रसायन के साथ मिलाया। यह अभिकर्मक (reagent) एक आणविक क्लैंप की तरह कार्य करता है, जो अस्थिर अطimpurity पर जकड़ लेता है और उसे हाइड्राज़ोन (hydrazone) नामक एक नई, मजबूत संरचना में लॉक कर देता है। यह नई संरचना मशीन के लिए देखना और मापना बहुत आसान है। हालांकि, शोधकर्ताओं ने जल्द ही पाया कि दवा का नमूना मौजूद होने पर यह सरल मिश्रण चरण विफल हो गया। एटोडोलैक दवा की प्राकृतिक अम्लता (acidity) ने अभिक्रिया में हस्तक्षेप किया, जिससे नया, स्थिर अणु मापे जाने से पहले ही टूट गया।

इस हस्तक्षेप को दूर करने के लिए, वैज्ञानिकों ने अभिक्रिया के वातावरण को समायोजित किया। उन्होंने मिश्रण में अमोनिया (ammonia) नामक एक क्षारीय पदार्थ मिलाया। इस चरण ने दवा की अम्लता को निष्प्रभावी कर दिया, जिससे एक शांत, संतुलित वातावरण बना जहाँ रासायनिक परिवर्तन बिना किसी व्यवधान के आगे बढ़ सके। फिर उन्होंने मिश्रण को पचास डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया और इसे साठ मिनट तक रहने दिया। इन विशिष्ट परिस्थितियों के तहत, रूपांतरण लगभग पूर्ण था, जिसमें अस्थिर अशुद्धि का निन्यानवे दशमलव नौ प्रतिशत सफलतापूर्वक स्थिर, पता लगाने योग्य रूप में परिवर्तित हो गया। यह इन-सीटू (in-situ) रणनीति, जिसका अर्थ है नमूने के भीतर ही रासायनिक कार्य करना, ने उन्हें मूल अणु की अस्थिरता और दवा मैट्रिक्स के हस्तक्षेप को दरकिनार करने की अनुमति दी।

रासायनिक रूपांतरण के सिद्ध होने के बाद, टीम ने पता लगाने के चरण की ओर रुख किया। उन्होंने UPLC-MS नामक एक परिष्कृत उपकरण का उपयोग किया, जो एक उच्च-गति तरल विभाजक (liquid separator) को मास स्पेक्ट्रोमीटर (mass spectrometer) के साथ जोड़ता है। तरल विभाजक एक उच्च-सटीक फिल्टर की तरह कार्य करता है, जो अणुओं को इस आधार पर छाँटता है कि वे एक ट्यूब के माध्यम से कैसे चलते हैं, जबकि मास स्पेक्ट्रोमीटर एक अत्यधिक संवेदनशील तराजू की तरह कार्य करता है जो अणुओं को पहचानने के लिए उनके वजन को मापता है। शोधकर्ताओं ने मशीन को विशेष रूप से उनके नए बने हाइड्राज़ोन अणु के वजन को खोजने के लिए ट्यून किया। उन्होंने पाया कि यह विधि अविश्वसनीय रूप से निम्न स्तरों पर अशुद्धि का पता लगा सकती है, जिसका डिटेक्शन लिमिट शून्य दशमलव शून्य छह आठ पांच आठ नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर (0.06858 ng/mL) जितना कम है। यह संवेदनशीलता अंतरराष्ट्रीय दिशानिर्देशों द्वारा निर्धारित सुरक्षा सीमा से बहुत नीचे है, जो दवा में अशुद्धि के लिए अधिकतम एक दशमलव पांच पार्ट्स प्रति मिलियन (1.5 ppm) की अनुमति देती है।

शोधकर्ताओं ने अपने नए तरीके को विश्वसनीय, सटीक और सुसंगत बनाने के लिए कड़ाई से परीक्षण किया। उन्होंने जांचा कि क्या मशीन अशुद्धि को स्वयं दवा से अलग कर सकती है, और इसने बिना किसी भ्रम के ऐसा किया। उन्होंने परीक्षण किया कि विधि अशुद्धि की विभिन्न मात्राओं को कितनी अच्छी तरह माप सकती है, जिससे पता चला कि सबसे कम पता लगाने योग्य मात्रा से लेकर उच्च सांद्रता तक एक सीधी, अनुमानित रेखा मिलती है। उन्होंने यह भी जांचा कि क्या परिणाम बदल जाएंगे यदि अलग-अलग लोग परीक्षण करते हैं या यदि तापमान थोड़ा भिन्न होता है, और विधि इन सभी स्थितियों के तहत भी कायम रही। टीम ने पुष्टि की कि अशुद्धि का नया रासायनिक रूप समाधान में कम से कम आठ घंटों तक स्थिर रहता है, जिससे उन्हें परीक्षण चलाने के लिए पर्याप्त समय मिलता है।

अंत में, टीम ने अपने नए तरीके को अपने सुविधा में उत्पादित एटोडोलैक के दस अलग-अलग बैचों पर लागू किया। उन्होंने प्रत्येक बैच का सावधानीपूर्वक विश्लेषण किया, उस खतरनाक अशुद्धि के किसी भी संकेत की तलाश की। परिणाम स्पष्ट था: दस के दस बैचों में अशुद्धि का पता नहीं चला। इसका मतलब यह नहीं था कि विधि खराब थी; इसके विपरीत, जोड़ी गई अशुद्धियों के साथ पिछले परीक्षणों ने सिद्ध किया था कि यदि वह वहाँ होती तो विधि उसे खोजने के लिए पर्याप्त संवेदनशील थी। उत्पादन बैचों में सिग्नल की अनुपस्थिति का अर्थ था कि निर्माण प्रक्रिया सफलतापूर्वक अशुद्धि के स्तर को पता लगाने की सीमा से नीचे रख रही है, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि दवा सुरक्षित है। यह कार्य एक मजबूत, व्यावहारिक गुणवत्ता नियंत्रण उपकरण प्रदान करता है, जो निर्माताओं को आत्मविश्वास के उस स्तर के साथ एटोडोलैक की सुरक्षा की निगरानी करने और गारंटी देने की अनुमति देता है जो पहले प्राप्त करना कठिन था।