Integrated RNA-based functional characterization facilitates reclassification of BRCA1/2 variants of uncertain significance in a clinical cancer cohort

تحمل كل خلية في جسم الإنسان مجموعة من التعليمات، مكتوبة بشفرة كيميائية تسمى الحمض النووي (DNA)، تخبرها كيف تبني نفسها وتحافظ عليها. ومن بين هذه التعليمات جينات محددة تعمل كحراس، تقوم باستمرار بإصلاح التلف في الشفرة الوراثية لمنع الخلايا من النمو بشكل خارج عن السيطرة لتصبح سرطاناً. اثنان من أهم هؤلاء الحراس هما جينان يسميان BRCA1 وBRCA2. عندما تعمل هذه الجينات بشكل صحيح، فإنها تساعد في إصلاح خيوط الحمض النووي المكسورة. ولكن عندما تتضرر هذه الجينات بسبب تغير في تسلسلها، وهو ما يعرف بالمتغير (variant)، يفشل نظام الإصلاح، ويرتفع خطر الإصابة بسرطان الثدي والمبيض وأنواع أخرى من السرطان بشكل كبير.

بالنسبة للأطباء والمرضى، فإن معرفة حالة هذه الجينات هي أداة قوية؛ إذ يمكنها توجيه القرارات المتعلقة بالفحص والوقاية والعلاج. ومع ذلك، فإن القصة ليست بسيطة دائماً. فغالباً ما يكشف الاختبار الجيني عن تغيرات في تسلسل الحمض النووي لم تُشاهد من قبل أو لا تُعرف آثارها. تُسمى هذه التغيرات "متغيرات ذات أهمية غير محددة"، وهي بمثابة علامات استفهام جينية. لا يستطيع الطبيب إخبار المريض ما إذا كان مثل هذا التغيير ضاراً أم حميداً بناءً على تسلسل الحمض النووي وحده. ويترك هذا الغموض العائلات في موقف صعب، غير قادرة على اتخاذ خيارات مدروسة تماماً بشأن صحتها. ويتمثل التحدي في اكتشاف ما تفعله هذه التغيات الغامضة فعلياً داخل الخلية.

قرر فريق من الباحثين في مستشفى تشونغشان في شنغهاي معالجة هذه المشكلة من خلال النظر في الخطوة التالية في العملية الجينية: كيف تُقرأ تعليمات الحمض النووي وتُنسخ إلى حمض نووي ريبوزي (RNA). في الخلية، يتم نسخ الحمض النووي أولاً إلى جزيء يسمى RNA، والذي يعمل بعد ذلك كقالب لبناء البروتينات. وقبل أن يمكن استخدام هذا الـ RNA، يجب تعديله. تخيل جملة طويلة تحتوي على عدة جمل فرعية؛ يجب على الخلية قص الأجزاء غير الضرورية ووصل الأجزاء المهمة معاً لتكوين رسالة واضحة. تسمى عملية التعديل هذه "التضفير" (splicing). وإذا أدى متغير جيني إلى تعطيل عملية التضفير هذه، تصبح الرسالة النهائية مشوشة، وقد يكون البروتين الناتج مكسوراً أو مفقوداً تماماً. اشتبه الباحثون في أن العديد من المتغيرات غير المحددة التي واجهوها كانت تسبب أخطاء في التضفير، لكن برامج الكمبيوتر المستخدمة للتنبؤ بمثل هذه الأخطاء كانت غالباً غير موثوقة أو تعطي إجابات متضاربة.

وللحصول على إجابة حاسمة، بدأ الباحثون بمجموعة كبيرة مكونة من 1,762 مريضاً خضعوا للاختبار الجيني للسرطان الوراثي. ومن هذه المجموعة، حددوا 60 متغيراً فريداً من نوع "الأهمية غير المحددة" في جينات BRCA1 وBRCA2. وعرفوا أنهم لا يستطيعون اختبار جميعها في مرضى أحياء، لذا استخدموا استراتيجية مخبرية ذكية. لقد أخذوا قطعاً صغيرة من الحمض النووي تحتوي على المناطق المحددة حيث وقعت المتغيرات، وأدخلوها في نظام اصطناعي بسيط داخل خلايا بشرية مزروعة في طبق. هذا النظام، المعروف باسم "المينيجين" (minigene)، عمل كمصنع مصغر ينتج RNA بناءً على التعليمات الموجودة في الحمض النووي المدرج. ومن خلال مراقبة الـ RNA الخارج من هذا المصنع، استطاع العلماء رؤية كيف تعالج الخلية التعليمات الجينية بدقة.

اختاروا خمسة من أكثر المرشحين واعداً لهذه التجربة، مع التركيز على تلك التي أشارت نماذج الكمبيوتر إلى أنها قد تسبب مشاكل في التضفير. كانت النتائج كاشفة؛ فقد تسبب اثنان من المتغيرات، وكلاهما يقع في جين BRCA2، في جعل الخلية ترتكب أخطاء في كيفية حياكة الـ RNA معاً. تسبب أحد هذين التغييرين في جعل الخلية تتخطى قسماً كاملاً من التعليمات، بينما تسبب الآخر في خطأ أكثر تعقيداً حيث تخطت الخلية قسماً واستولت أيضاً على نقاط بداية خاطئة قريبة. أدت هذه الأخطاء إلى رسائل RNA تفتقر إلى أجزاء حيوية من المعلومات. أما المتغيرات الثلاثة الأخرى التي اختبروها فلم تسبب أي أخطاء؛ فقد عالجتها الخلايا تماماً كما كانت ستعالج الحمض النووي الطبيعي.

لم يتوقف الباحثون عند مجرد رؤية وقوع الأخطاء، بل أرادوا فهم الشكل الكامل للخطأ. وباستخدام تقنية تسمى "تسلسل الحمض النووي الريبوزي" (RNA sequencing)، قرأوا التسلسل الدقيق لجزيئات الـ RNA المعيبة الناتجة عن المتغيرين الإشكاليين. أكد ذلك أن الأخطاء كانت حقيقية وفصلت بالضبط الأجزاء المفقودة أو المضافة من الرسالة. وبالنسبة للمتغير الذي تسبب في التخطي، فقد توافق القسم المفقود مع امتداد يبلغ 52 وحدة بناء في البروتين النهائي. ولفهم معنى هذا الفقدان، استخدم الفريق عمليات محاكاة حاسوبية قوية لنمذجة بنية بروتين BRCA2. ووجدوا أن القسم المفقود يقع في منطقة حرجة حيث يتفاعل البروتين مع جزيء آخر لأداء عمله في الإصلاح. وبينما لم تستطع المحاكاة إثبات أن البروتين مكسور تماماً، إلا أنها أظهرت أن الجزء المفقود جاء من جزء منظم بدقة وجوهري من البنية، مما يشير إلى أن البروتين من المرجح ألا يعمل بشكل صحيح.

جاءت القطعة الأخيرة من اللغز من خلال النظر في عائلات المرضى. تتبع الباحثون التاريخ الجيني للمتغيرين اللذين سببا أخطاء في التضفير، ووجدوا أن هذه التغييرات ظهرت لدى عدة أفراد من العائلة، بعضهم أصيب بالسرطان والبعض الآخر لم يصب به. ورغم أن هذا النمط لم يكن مطابقاً تماماً لمرض يضرب دائماً، إلا أنه قدم دليلاً داعماً على أن هذه المتغيرات مرتبطة بالفعل بالمرض. ومن خلال الجمع بين الإثبات المخبري لأخطاء التضفير، ونماذج الكمبيوتر لبنية البروتين، والتاريخ العائلي، تمكن الفريق من إعادة تصنيف المتغيرين الضارين؛ حيث نقلوهما من فئة "غير محددة" إلى "مرجح أن يكون ممرضاً" و"ممرض"، مما منح الأطباء والمرضى إجابة واضحة. أما المتغيرات الثلاثة التي لم تسبب أي أخطاء، فقد أعيد تصنيفها على أنها "حميدة على الأرجح".

توضح هذه الدراسة أنه عندما يترك الاختبار الجيني علامة استفهام، فإن النظر في كيفية قراءة الخلية للحمض النووي فعلياً يمكن أن يقدم الإجابة. أظهر الباحثون أن تنبؤات الكمبيوتر وحدها غالباً ما تكون غير كافية لحل هذه الألغاز لأن آليات التعديل في الخلية يمكن أن تتصرف بطرق معقدة وغير متوقعة. يمكن لتغيير واحد في الحمض النووي أن يؤدي إلى أنواع متعددة ومختلفة من الأخطاء، أو قد لا يكون له أي تأثير على الإطلاق. ومن خلال استخدام مزيج من التجارب المخبرية، والتسلسل التفصيلي، والنمذجة الهيكلية، تمكن الفريق من اختراق حالة الغموض. إن عملهم يقدم مساراً عملياً لحل أسئلة جينية مماثلة، محولاً المخاطر الغامضة إلى توجيه طبي واضح للعائلات التي تواجه تهديد السرطان الوراثي.