Integrated RNA-based functional characterization facilitates reclassification of BRCA1/2 variants of uncertain significance in a clinical cancer cohort

Jede Zelle im menschlichen Körper trägt einen Satz von Anweisungen, die in einem chemischen Code namens DNA geschrieben sind und ihr sagen, wie sie sich selbst aufbauen und erhalten kann. Unter diesen Anweisungen befinden sich spezifische Gene, die als Wächter fungieren und ständig Schäden am genetischen Code reparieren, um zu verhindern, dass Zellen unkontrolliert wachsen und zu Krebs werden. Zwei der wichtigsten Wächter sind die Gene namens BRCA1 und BRCA2. Wenn diese Gene korrekt arbeiten, helfen sie dabei, beschädigte DNA-Stränge zu reparieren. Wenn diese Gene jedoch durch eine Veränderung in ihrer Sequenz, bekannt als Variante, beschädigt werden, versagt das Reparatursystem, und das Risiko, Brust-, Eierstock- und andere Krebsarten zu entwickeln, steigt erheblich an.

Für Ärzte und Patienten ist das Wissen über den Status dieser Gene ein mächtiges Werkzeug. Es kann Entscheidungen über Vorsorge, Prävention und Behandlung leiten. Die Geschichte ist jedoch nicht immer einfach. Genetische Tests offenbaren oft Veränderungen in der DNA-Sequenz, die noch nie zuvor gesehen wurden oder deren Auswirkungen unbekannt sind. Dies sind Varianten unklarer Signifikanz. Sie sind genetische Fragezeichen. Ein Arzt kann einem Patienten nicht allein basierend auf der DNA-Sequenz sagen, ob eine solche Veränderung harmlos oder gefährlich ist. Diese Ungewissheit stellt Familien in eine schwierige Lage, da sie nicht in der Lage sind, voll informierte Entscheidungen über ihre Gesundheit zu treffen. Die Herausforderung besteht darin, herauszufinden, was diese geheimnisvollen Veränderungen tatsächlich innerhalb der Zelle bewirken.

Ein Forscherteam am Zhongshan Hospital in Shanghai beschloss, dieses Problem anzugehen, indem es den nächsten Schritt im genetischen Prozess untersuchte: wie die DNA-Anweisungen gelesen und in RNA kopiert werden. In der Zelle wird DNA zuerst in ein Molekül namens RNA transkribiert, welches dann als Vorlage für den Aufbau von Proteinen dient. Bevor diese RNA verwendet werden kann, muss sie editiert werden. Stellen Sie sich einen langen Satz mit mehreren Nebensätzen vor; die Zelle muss die unnötigen Teile herausschneiden und die wichtigen Teile zusammenfügen, um eine klare Botschaft zu bilden. Dieser Editierungsprozess wird Spleißen genannt. Wenn eine genetische Variante dieses Spleißen stört, wird die endgültige Botschaft verstümmelt, und das resultierende Protein kann beschädigt oder gänzlich fehlen. Die Forscher vermuteten, dass viele der ihnen begegneten unsicheren Varianten solche Spleißfehler verursachen, aber die Computerprogramme, die solche Fehler vorhersagen sollen, waren oft unzuverlässig oder lieferten widersprüchliche Antworten.

Um eine definitive Antwort zu erhalten, begannen die Forscher mit einer großen Gruppe von 1.762 Patienten, die sich einer genetischen Untersuchung auf erbliches Krebsrisiko unterzogen hatten. Aus dieser Gruppe identifizierten sie 60 einzigartige Varianten unklarer Signifikanz in den BRCA1- und BRCA2-Genen. Sie wussten, dass sie nicht alle von ihnen an lebenden Patienten testen konnten, also nutzten sie eine kluge Laborstrategie. Sie nahmen kleine DNA-Stücke, die die spezifischen Regionen enthielten, in denen die Varianten auftraten, und fügten sie in ein einfaches, künstliches System in menschlichen Zellen ein, die in einer Kulturschale gezüchtet wurden. Dieses System, bekannt als Minigen, fungierte als eine Art Miniaturfabrik, die RNA basierend auf den Anweisungen in der eingefügten DNA produzieren würde. Indem sie beobachteten, welche RNA aus dieser Fabrik kam, konnten die Wissenschaftler genau sehen, wie die Zelle die genetischen Anweisungen verarbeitet.

Sie wählten fünf der vielversprechendsten Kandidaten für dieses Experiment aus, wobei sie sich auf jene konzentrierten, die laut Computermodellen Spleißprobleme verursachen könnten. Die Ergebnisse waren aufschlussreich. Zwei der Varianten, beide im BRCA2-Gen lokalisiert, verursachten bei der Zelle Fehler beim Zusammenfügen der RNA. Eine dieser Veränderungen bewirkte, dass die Zelle einen kompletten Abschnitt der Anweisungen übersprang, während die andere einen komplexeren Fehler verursachte, bei dem die Zelle einen Abschnitt übersprang und zudem benachbarte Startpunkte falsch erfasste. Diese Fehler führten dazu, dass die RNA-Botschaften kritische Informationen vermissen ließen. Die anderen drei Varianten, die sie testeten, verursachten keine Fehler; die Zellen verarbeiteten sie genauso, wie sie normale DNA verarbeitet hätten.

Die Forscher blieben nicht dabei, lediglich zu sehen, dass Fehler auftraten. Sie wollten die volle Form des Fehlers verstehen. Mithilfe einer Technik namens RNA-Sequenzierung lasen sie die exakte Sequenz der fehlerhaften RNA-Moleküle, die von den zwei problematischen Varianten produziert wurden. Dies bestätigte, dass die Fehler real waren, und detaillierte genau, welche Teile der Nachricht fehlten oder hinzugefügt wurden. Für die Variante, die ein Überspringen verursachte, entsprach der fehlende Abschnitt einem Bereich von 52 Bausteinen im fertigen Protein. Um zu verstehen, was dieser Verlust bedeutete, nutzte das Team leistungsstarke Computersimulationen, um die Struktur des BRCA2-Proteins zu modellieren. Sie fanden heraus, dass der fehlende Abschnitt in einem kritischen Bereich liegt, in dem das Protein mit einem anderen Molekül interagiert, um seine Reparaturarbeit zu leisten. Obwohl die Simulation nicht beweisen konnte, dass das Protein vollständig defekt ist, zeigte sie, dass das fehlende Stück aus einem eng organisierten und essenziellen Teil der Struktur stammt, was darauf hindeutet, dass das Protein wahrscheinlich nicht richtig funktionieren wird.

Das letzte Puzzleteil ergab sich durch die Betrachtung der Familien der Patienten. Die Forscher verfolgten die genetische Geschichte der zwei Varianten, die Fehler verursachten. Sie fanden heraus, dass diese Veränderungen bei mehreren Familienmitgliedern auftraten, von denen einige an Krebs erkrankt waren und andere nicht. Obwohl dieses Muster keine perfekte Übereinstimmung mit einer Krankheit darstellt, die immer auftritt, lieferte es unterstützende Beweise dafür, dass diese Varianten tatsächlich mit der Krankheit verknüpft waren. Durch die Kombination der Laborexperimente zum Nachweis der Spleißfehler, der Computermodelle der Proteinstruktur und der Familiengeschichte war das Team in der Lage, die zwei schädlichen Varianten neu zu klassifizieren. Sie verschoben sie von der Kategorie „unsicher“ zu „wahrscheinlich pathogen“ und „pathogen“, wodurch sie Ärzten und Patienten eine klare Antwort gaben. Die drei Varianten, die keine Fehler verursachten, wurden als wahrscheinlich harmlos umklassifiziert.

Diese Studie zeigt, dass, wenn genetische Tests ein Fragezeichen hinterlassen, der Blick darauf, wie die Zelle die DNA tatsächlich liest, die Antwort liefern kann. Die Forscher zeigten, dass Computervorhersagen allein oft nicht ausreichen, um diese Rätsel zu lösen, da sich die Editierungsmechanismen der Zelle komplex und unerwartet verhalten können. Eine einzige Veränderung in der DNA kann zu mehreren verschiedenen Arten von Fehlern führen, oder sie kann gar keine Wirkung haben. Durch den Einsatz einer Kombination aus Laborexperimenten, detaillierter Sequenzierung und Strukturmodellierung war das Team in der Lage, die Ungewissheit zu durchbrechen. Ihre Arbeit bietet einen praktischen Weg nach vorn, um ähnliche genetische Fragen zu klären und vage Risiken in klare medizinische Orientierungshilfe für Familien zu verwandeln, die der Bedrohung durch erblichen Krebs gegenüberstehen.