Integrated RNA-based functional characterization facilitates reclassification of BRCA1/2 variants of uncertain significance in a clinical cancer cohort

Elke cel in het menselijk lichaam bevat een set instructies, geschreven in een chemische code genaamd DNA, die de cel vertelt hoe hij zichzelf moet opbouwen en onderhouden. Onder deze instructies bevinden zich specifieke genen die fungeren als bewakers, die constant de schade aan de genetische code repareren om te voorkomen dat cellen ongecontroleerd groeien en kanker worden. Twee van de belangrijkste bewakers zijn genen genaamd BRCA1 en BRCA2. Wanneer deze genen correct werken, helpen ze bij het herstellen van gebroken strengen van DNA. Maar wanneer deze genen beschadigd raken door een verandering in hun sequentie, een variant genoemd, faalt het reparatiesysteem en stijgt het risico op het ontwikkelen van borst-, eierstok- en andere soorten kanker aanzienlijk.

Voor artsen en patiënten is het kennen van de status van deze genen een krachtig hulpmiddel. Het kan beslissingen sturen over screening, preventie en behandeling. De geschiedenis is echter niet altijd eenvoudig. Genetische tests onthullen vaak veranderingen in de DNA-sequentie die nog nooit eerder zijn gezien of waarvan de effecten onbekend zijn. Dit worden varianten van onzekere betekenis genoemd. Het zijn genetische vraagtekens. Een arts kan een patiënt niet vertellen of een dergelijke verandering onschadelijk of gevaarlijk is op basis van de DNA-sequentie alleen. Deze onzekerheid laat families in een moeilijke positie, niet in staat om volledig geïnformeerde keuzes te maken over hun gezondheid. De uitdaging is om uit te zoeken wat deze mysterieuze veranderingen daadwerkelijk doen in de cel.

Een team van onderzoekers aan het Zhongshan Hospital in Shanghai besloot dit probleem aan te pakken door naar de volgende stap in het genetische proces te kijken: hoe de DNA-instructies worden gelezen en gekopieerd naar RNA. In de cel wordt DNA eerst getranscribeerd naar een molecuul genaamd RNA, dat vervolgens dient als sjabloon voor het bouwen van eiwitten. Voordat dit RNA gebruikt kan worden, moet het worden bewerkt. Stel je een lange zin voor met verschillende clausules; de cel moet de onnodige delen eruit knippen en de belangrijke delen aan elkaar naaien om een heldere boodschap te vormen. Dit bewerkingsproces wordt splicing genoemd. Als een genetische variant dit bewerkingsproces verstoort, wordt de uiteindelijke boodschap onverstaanbaar en kan het resulterende eiwit beschadigd of zelfs geheel ontbreken. De onderzoekers vermoedden dat veel van de onzekere varianten die zij tegenkwamen, dergelijke splicingfouten veroorzaakten, maar de computerprogramma's die werden gebruikt om dergelijke fouten te voorspellen, waren vaak onbetrouwbaar of gaven tegenstrijdige antwoorden.

Om een definitief antwoord te krijgen, begonnen de onderzoekers met een grote groep van 1.762 patiënten die een genetische test hadden ondergaan voor erfelijke kanker. Uit deze groep identificeerden zij 60 unieke varianten van onzekere betekenis in de BRCA1- en BRCA2-genen. Ze wisten dat ze niet al deze varianten in levende patiënten konden testen, dus gebruikten ze een slimme laboratoriumstrategie. Ze namen kleine stukjes DNA die de specifieke regio's bevatten waar de varianten voorkwamen en plaatsten deze in een eenvoudig, kunstmatig systeem in menselijke cellen die in een schaal werden gekweekt. Dit systeem, bekend als een minigene, fungeerde als een miniatuurfabriek die RNA zou produceren op basis van de instructies in het ingevoegde DNA. Door te kijken welke RNA er uit deze fabriek kwam, konden de wetenschappers precies zien hoe de cel de genetische instructies verwerkte.

Ze selecteerden vijf van de meest veelbelovende kandidaten voor dit experiment, waarbij ze zich concentreerden op de varianten waarvan de computermodellen suggereerden dat ze splicingproblemen zouden kunnen veroorzaken. De resultaten waren onthullend. Twee van de varianten, beide gelokaliseerd in het BRCA2-gen, zorgden ervoor dat de cel fouten maakte in de manier waarop de RNA aan elkaar werd genaaid. Eén van deze veranderingen zorgde ervoor dat de cel een hele sectie van de instructies overs old, terwijl de andere een complexere fout veroorzaakte waarbij de cel een sectie overs old en ook de verkeerde startpunten in de buurt greep. Deze fouten resulteerden in RNA-boodschappen die cruciale stukken informatie misten. De andere drie varianten die zij testten, veroorzaakten geen fouten; de cellen verwerkten deze net zoals ze normaal DNA zouden hebben verwerkt.

De onderzoekers stopten niet bij het simpelweg zien dat er fouten optraden. Ze wilden de volledige vorm van de fout begrijpen. Met behulp van een techniek genaamd RNA-sequencing lazen ze de exacte sequentie van de defecte RNA-moleculen die door de twee problematische varianten werden geproduceerd. Dit bevestigde dat de fouten echt waren en details gaf over welke delen van de boodschap ontbraken of toegevoegd waren. Voor de variant die een overslag veroorzaakte, kwam de ontbrekende sectie overeen met een stuk van 52 bouwstenen in het uiteindelijke eiwit. Om te begrijpen wat dit verlies betekende, gebruikten het team krachtige computersimulaties om de structuur van het BRCA2-eiwit te modelleren. Ze ontdekten dat de ontbrekende sectie zich bevond in een kritiek gebied waar het eiwit met een ander molecuul interageert om zijn reparatiewerk uit te voeren. Hoewel de simulatie niet kon bewijzen dat het eiwit volledig defect was, toonde het wel aan dat het ontbrekende deel afkomstig was van een strak georganiseerd en essentieel onderdeel van de structuur, wat suggereert dat het eiwit waarschijnlijk niet goed zal functioneren.

Het laatste puzzelstuk kwam voort uit het kijken naar de families van de patiënten. De onderzoekers volgden de genetische geschiedenis van de twee varianten die fouten veroorzaakten. Zij ontdekten dat deze veranderingen bij meerdere familieleden voorkwamen, van wie sommigen kanker hadden ontwikkeld en anderen niet. Hoewel dit patroon geen perfecte match was voor een ziekte die altijd toeslaat, leverde het ondersteunend bewijs dat deze varianten inderdaad verbonden waren met de ziekte. Door de laboratoriumbewijzen van de splicingfouten te combineren met de computermodellen van de eiwitstructuur en de familiegeschiedenis, was het team in staat de twee schadelijke varianten te herclassificeren. Ze verplaatsten ze van de categorie "onzeker" naar "waarschijnlijk pathogeen" en "pathogeen", waardoor artsen en patiënten een duidelijk antwoord kregen. De drie varianten die geen fouten veroorzaakten, werden geherclassificeerd als waarschijnlijk onschadelijk.

Dit onderzoek toont aan dat wanneer genetische tests een vraagteken achterlaten, kijken naar hoe de cel het DNA daadwerkelijk leest, het antwoord kan bieden. De onderzoekers toonden aan dat computervoorspellingen alleen vaak niet voldoende zijn om deze mysteries op te lossen, omdat de bewerkingsmechanismen van de cel op complexe en onverwachte manieren kunnen reageren. Een enkele verandering in het DNA kan leiden tot meerdere verschillende soorten fouten, of het kan helemaal geen effect hebben. Door een combinatie van laboratoriumexperimenten, gedetailleerde sequencing en structurele modellering te gebruiken, slaagde het team erin de onzekerheid weg te nemen. Hun werk biedt een praktisch pad voor het oplossen van soortgelijke genetische vragen, waarbij vage risico's worden omgezet in duidelijke medische begeleiding voor families die geconfronteerd worden met de dreiging van erfelijke kanker.