Recombinase Polymerase Amplification Coupled with CRISPR-Cas12a for Rapid Detection of Ciprofloxacin-Resistance Mutations in Clinical Urinary Isolates

تعد الالتهابات البكتيرية في المسالك البولية من بين أكثر الأمراض شيوعاً التي يتم علاجها في المستشفيات والعيادات حول العالم. وبينما تُشفى حالات كثيرة من تلقاء نفسها أو مع الرعاية البسيطة، تتطلب حالات أخرى مضادات حيوية لمنع انتشار العدوى. لعدة عقود، اعتمد الأطباء على فئة من الأدوية تسمى "فلوروكينولونات" لعلاج هذه الالتهابات لأنها تعمل بشكل جيد وسهلة التناول. ومع ذلك، فإن البكتيريا ذكية وقادرة على التكيف؛ فمع مرور الوقت، تعلمت العديد منها تجاهل هذه الأدوية، مما جعلها عديمة الفائدة. وعندما يصاب المريض بسلالة مقاومة، يفشل العلاج القياسي، ويمكن أن تصبح العدوى خطيرة. إن الطريقة الحالية لمعرفة ما إذا كانت بكتيريا معينة مقاومة تتضمن زراعة الجرثومة في طبق مختبري ومراقبة كيفية تفاعلها مع الدواء. هذه العملية موثوقة ولكنها بطيئة، إذ تستغرق غالباً من يوم إلى ثلاثة أيام لإعطاء نتيجة. وفي غضون ذلك، قد يتلقى المرضى الدواء الخاطئ، أو قد تسوء العدوى. لطالاً، سعى العلماء لإيجاد طريقة أسرع للكشف عن المقاومة، طريقة تنظر مباشرة إلى الشفرة الوراثية للبكتيريا للعثور على التغييرات المحددة التي تجعلها محصنة ضد العلاج.

لقد طور فريق من الباحثين طريقة جديدة تجمع بين أداتين بيولوجيتين قويتين لحل هذه المشكلة. الأداة الأولى هي تقنية تعمل مثل "آلة تصوير جزيئية"، قادرة على صنع ملايين النسخ من قطعة معينة من الحمض النووي البكتيري في خطوة واحدة، دون الحاجة إلى دورات التسخين والتبريد المعقدة للآلات التقليدية. الأداة الثانية هي نظام "مقصات جزيئية"، تم اكتشافه في الأصل كدفاع مناعي بكتيري، ويمكن برمجته للبحث عن تسلسل محدد جداً من الحروف الجينية. عندما يجد هذا النظام هدفه، ينفتح ويقطع علامة كيميائية مضيئة، مما يخلق إشارة يمكن رؤيتها بالعين المجردة تحت ضوء فوق بنفسجي بسيط. ومن خلال ربط هاتين الأداتين معاً، ابتكر الباحثون اختباراً يمكنه تحديد الطفرات الجينية المسؤولة عن مقاومة "سيبروفلوكساسين" في غضمة ساعة واحدة فقط.

اختبر الباحثون هذا النظام الجديد على 137 عينة واقعية تم جمعها من مرضى يعانون من التهابات المسالك البولية. جاءت هذه العينات من ثلاثة من أكثر أنواع البكتيريا شيوعاً التي تسبب هذه الالتهابات، وهي: الإشريكية القولونية (Escherichia coli)، والكلبسيلة الرئوية (Klebsiella pneumoniae)، والبروتيس ميرابيليس (Proteus mirabilis). وقبل اختبار طريقتهم الجديدة، قام الفريق أولاً برسم الخريطة الجينية لهذه البكتيريا باستخدام تقنية تسلسل تعتبر المعيار الذهبي. ووجدوا أن المقاومة في هذه البكتيريا تأتي عادة من تغيرات طفيفة في جينات محددة تتحكم في كيفية بناء الآليات الداخلية للبكتيريا. في بكتيريا الإشريكية القولونية، تضمن نمط المقاومة الأكثر شيوعاً عمل تغيرين محددين معاً، بينما كانت التغيرات في النوعين الآخرين مختلفة قليلاً. وقد أكد هذا أن تصميماً واحداً للاختبار لن يصلح لجميع أنواع البكتيريا؛ بل يجب تخصيص الاختبار ليتناسب مع البصمة الجينية لكل نوع.

بعد ذلك، صمم الفريق سبعة "أدلة" جينية فريدة للبحث عن هذه الطفرات المحددة. تمت برمجة كل دليل للتعرف فقط على النسخة المتحورة من الجين التي تسبب المقاومة، مع تجاهل النسخة الطبيعية السليمة. وعندما أجروا اختبارهم الجديد على 137 عينة، كانت النتائج مذهلة. بالنسبة لعينات الإشريكية القولونية، نجح الاختبار في تحديد كل واحدة من الـ 18 بكتيريا التي كانت معروفة بأنها مقاومة للدواء، ولكن فقط عندما دمج الباحثون عدة أدلة في لوحة واحدة للبحث عن مختلف طفرات المقاومة المحتملة. وقد فعل ذلك من خلال البحث عن أي من طفرات المقاومة المعروفة ووضع علامة عليها. كما كان الاختبار دقيقاً للغاية بالنسبة لبكتيريا البروتيس ميرابيليس، حيث رصد 95 بالمائة من الحالات المقاومة. أما بالنسبة لـ الكلبسيلة الرئوية، فقد وجد الاختبار 58 بالمائة من الحالات المقاومة. وأشار الباحثون إلى أن الحالات التي لم يتم رصدها في هذه المجموعة كانت على الأرجح بسبب نوع مختلف من آليات المقاومة لا يتضمن الجينات المحددة التي كانوا يبحثون عنها، مما يعني أن الاختبار ليس مثالياً لكل نوع من أنواع المقاومة، ولكنه فعال للغاية لأكثر الأسباب الجينية شيوعاً.

كان أحد أهم الاكتشافات هو كيفية تعامل الاختبار مع البكتيريا التي لم تصبح مقاومة بالكامل بعد. فقد رصد الاختبار أحياناً بكتيريا بدأت في تطوير طفرة مقاومة ولكنها لم تصبح مقاومة تماماً للدواء بعد. وأوضح الباحثون أن هذا ليس خطأً، بل هو ميزة. في حالة الإشريكية القولونية، رصد الاختبار خمس بكتيريا كانت "ظاهرياً" قابلة للتأثر بالدواء؛ ومع ذلك، أكد التسلسل الجيني أن هذه العينات الخمس تحمل طفرة "الخطوة الأولى" (S83L) التي هي المرحلة الأولية لتطوير المقاومة. وبينما لم تكن هذه البكتيريا مقاومة في المختبر، إلا أنها امتلكت التغيير الجيني الذي يسبق المقاومة الكاملة. وأشار الباحثون إلى أن هذا ليس "إيجابياً كاذباً" بالمعنى التقليدي، بل هو رصد لنمط جيني "ما قبل المقاومة". ويمكن أن يكون هذا مفيداً للغاية للأطباء، مما يسمح لهم بتغيير العلاجات مبكراً قبل أن تصبح العدوى أصعب في العلاج. والأهم من ذلك، أن الاختبار لم يحدد أي بكتيريا على أنها مقاومة إذا كانت تفتقر إلى الطفرة الجينية المحددة المرتبطة بالمقاومة؛ فكل إشارة إيجابية كانت تتوافق مع تغيير جيني حقيقي، حتى لو لم يؤدِ ذلك التغيير بعد إلى مقاومة كاملة للدواء.

العملية برمتها بسيطة وسريعة بشكل ملحوظ. وخلافاً للاختبارات الجينية التقليدية، التي تتطلب آلات ضخمة وباهظة الثمن تمر بدورات درجات حرارة مختلفة، تعمل هذه الطريقة الجديدة عند درجة حرارة دافئة ثابتة واحدة. استطاع الباحثون استخراج الحمض النووي من البكتيريا ببسال غليها في الماء، ثم خلط العينة مع الكواشف، والانتظار. وفي غضونة ساعة، يمكنهم النظر إلى الأنبوب تحت ضوء فوق بنفسجي. إذا كانت البكتيريا مقاومة، فسيضيء السائل. وإذا لم تكن كذلك، فسيظل مظلماً. هذه البساطة تعني أنه يمكن استخدام الاختبار في النهاية في العيادات الصغيرة أو المناطق ذات الموارد المحدودة حيث لا تتوفر المعدات المعقدة.

تثبت الدراسة أنه من الممكن تجاوز الاختبارات البطيئة القائمة على الزراعة، والكشف مباشرة عن الجذور الجينية لمقاومة المضادات الحيوية في جزء بسيط من الوقت. ومن خلال الجمع بين طريقة سريعة لنسخ الحمض النووي وأداة بحث جينية دقيقة، أنشأ الباحثون نظاماً يتسم بالسرعة والدقة لأكثر أنواع التهابات المسالك البولية شيوعاً. وبينما لا يرصد الاختبار كل طريقة ممكنة لتصبح بها البكتيريا مقاومة، فإنه ينجح في تحديد الغالبية العظمى من الأسباب الجينية الأكثر شيوعاً. يقدم هذا النهج مساراً واعداً نحو قرارات علاجية أسرع وأكثر ذكاءً، مما يساعد في ضمان تلقي المرضى للمضاد الحيوي المناسب في وقت أقرب، ويبطئ من انتشار البكتيريا الخارقة المقاومة للأدوية.