Recombinase Polymerase Amplification Coupled with CRISPR-Cas12a for Rapid Detection of Ciprofloxacin-Resistance Mutations in Clinical Urinary Isolates

मूत्र मार्ग के जीवाणु संक्रमण (बैक्टेरियल इन्फेक्शन) दुनिया भर के अस्पतालों और क्लीनिकों में इलाज किए जाने वाले सबसे आम रोगों में से एक हैं। जबकि कई मामले अपने आप या साधारण देखभाल से ठीक हो जाते हैं, अन्य मामलों में संक्रमण को फैलने से रोकने के लिए एंटीबायोटिक्स की आवश्यकता होती है। दशकों से, डॉक्टर इन संक्रमणों के इलाज के लिए फ्लोरोक्विनोलोन (fluoroquinolones) नामक दवाओं के वर्ग पर भरोसा करते आए हैं क्योंकि वे प्रभावी रूप से काम करती हैं और लेने में आसान होती हैं। हालांकि, बैक्टीरिया चतुर और अनुकूलनशील होते हैं; समय के साथ, कई बैक्टीरिया ने इन दवाओं को अनदेखा करना सीख लिया है, जिससे वे बेकार हो गई हैं। जब कोई रोगी प्रतिरोधी स्ट्रेन (resistant strain) से संक्रमित होता है, तो मानक उपचार विफल हो जाता है, और संक्रमण खतरनाक हो सकता है। किसी विशिष्ट बैक्टीरिया के प्रतिरोधी होने का पता लगाने का वर्तमान तरीका लैब डिश में कीटाणुओं को उगाना और यह देखना है कि वे दवा के प्रति कैसी प्रतिक्रिया देते हैं। यह प्रक्रिया विश्वसनीय तो है लेकिन धीमी है, परिणाम देने में अक्सर एक से तीन दिन लग जाते हैं। इस दौरान, मरीजों को गलत दवा मिल सकती है, या संक्रमण बिगड़ सकता है। वैज्ञानिक लंबे समय से प्रतिरोध का पता लगाने के लिए एक तेज़ तरीके की तलाश में रहे हैं, जो सीधे बैक्टीरिया के जेनेटिक कोड को देखकर उन विशिष्ट परिवर्तनों को खोज सके जो उन्हें उपचार के प्रति प्रतिरोधी बनाते हैं।

शोधकर्ताओं की एक टीम ने इस समस्या को हल करने के लिए दो शक्तिशाली जैविक उपकरणों को मिलाकर एक नई विधि विकसित की है। पहला उपकरण एक ऐसी तकनीक है जो एक 'आणविक फोटोकॉपी मशीन' (molecular photocopier) की तरह कार्य करती है, जो पारंपरिक मशीनों के जटिल हीटिंग और कूलिंग चक्रों की आवश्यकता के बिना, एक ही चरण में बैक्टीरिया के डीएनए के एक विशिष्ट हिस्से की लाखों प्रतियां बना सकती है। दूसरा उपकरण एक 'आणविक कैंची' (molecular scissors) प्रणाली है, जिसे मूल रूप से एक बैक्टीरिया की प्रतिरक्षा रक्षा प्रणाली के रूप में खोजा गया था, जिसे विशिष्ट जेनेटिक अक्षरों के अनुक्रम को खोजने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है। जब यह प्रणाली अपने लक्ष्य को पाती है, तो यह खुल जाती है और एक चमकते हुए रासायनिक टैग को काट देती है, जिससे एक संकेत उत्पन्न होता है जिसे एक साधारण पराबैंगनी (ultraviolet) प्रकाश के नीचे नग्न आंखों से देखा जा सकता है। इन दोनों उपकरणों को एक साथ जोड़कर, शोधकर्ताओं ने एक ऐसा परीक्षण बनाया है जो केवल एक घंटे में सिप्रोफ्लोक्सासिन (ciprofloxacin) प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार जेनेटिक म्यूटेशन की पहचान कर सकता है।

शोधकर्ताओं ने इस नई प्रणाली का परीक्षण मूत्र मार्ग के संक्रमणों से पीड़ित रोगियों से एकत्र किए गए 137 वास्तविक दुनिया के बैक्टीरिया नमूनों पर किया। ये नमूने मूत्र मार्ग के संक्रमण पैदा करने वाले तीन सबसे सामान्य प्रकार के बैक्टीरिया से आए थे: एस्चेरिचिया कोली (Escherichia coli), क्लेबसिएला न्यूमोनिया (Klebsiella pneumoniae), और प्रोटियस मिराबिलिस (Proteus mirabilis)। अपने नए तरीके का परीक्षण करने से पहले, टीम ने एक गोल्ड-स्टैंडर्ड सीक्वेंसिंग तकनीक का उपयोग करके इन बैक्टीरिया के जेनेटिक परिदृश्य का मानचित्र तैयार किया। उन्होंने पाया कि इन बैक्टीरिया में प्रतिरोध आमतौर पर उन विशिष्ट जीन में होने वाले सूक्ष्म परिवर्तनों से आता है जो उनके आंतरिक मशीनरी के निर्माण को नियंत्रित करते हैं। ई. कोली में, सबसे आम प्रतिरोध पैटर्न में दो विशिष्ट परिवर्तन मिलकर काम करते थे, जबकि अन्य दो प्रजातियों में परिवर्तन थोड़े अलग थे। इसने पुष्टि की कि एक एकल परीक्षण डिजाइन सभी बैक्टीरिया के लिए काम नहीं करेगा; परीक्षण को प्रत्येक प्रजाति के विशिष्ट जेनेटिक सिग्नेचर के अनुसार तैयार करना होगा।

इसके बाद टीम ने इन विशिष्ट म्यूटेशन को खोजने के लिए सात अद्वितीय जेनेटिक "गाइड्स" (guides) डिजाइन किए। प्रत्येक गाइड को केवल उस उत्परिवर्तित (mutated) संस्करण को पहचानने के लिए प्रोग्राम किया गया था जो प्रतिरोध का कारण बनता है, जबकि वह सामान्य, स्वस्थ संस्करण को अनदेखा करता था। जब उन्होंने अपने नए परीक्षण को 137 नमूनों पर चलाया, तो परिणाम आश्चर्यजनक थे। ई. कोली के नमों के लिए, परीक्षण ने सफलतापूर्वक उन सभी 18 बैक्टीरिया की पहचान की जो दवा के प्रति प्रतिरोधी थे, लेकिन तभी जब शोधकर्ताओं ने विभिन्न संभावित प्रतिरोध म्यूटेशन को देखने के लिए कई गाइड्स को एक एकल पैनल में संयोजित किया। इसने किसी भी ज्ञात प्रतिरोध म्यूटेशन को ढूंढकर और उन्हें फ्लैग (flag) करके यह कार्य किया। यह प्रोटियस मिराबिलिस के लिए भी अत्यधिक सटीक था, जिसने 95 प्रतिशत प्रतिरोधी मामलों को पकड़ा। क्लेबसिएला न्यूमोनिया के लिए, परीक्षण ने 58 प्रतिशत प्रतिरोधी मामलों को पाया। शोधकर्ताओं ने नोट किया कि इस समूह में छूटे हुए मामले संभवतः एक अलग प्रकार के प्रतिरोध तंत्र के कारण थे जिसमें वे विशिष्ट जीन शामिल नहीं थे जिन्हें वे खोज रहे थे, जिसका अर्थ है कि परीक्षण हर प्रकार के प्रतिरोध के लिए पूर्ण नहीं है, लेकिन सबसे आम जेनेटिक कारणों के लिए अत्यधिक प्रभावी है।

सबसे महत्वपूर्ण निष्कर्षों में से एक यह था कि परीक्षण ने उन बैक्टीरिया के साथ कैसा व्यवहार किया जो अभी तक पूरी तरह से प्रतिरोधी नहीं हुए थे। परीक्षण ने कभी-कभी उन बैक्टीरिया को फ्लैग किया जिन्होंने प्रतिरोध म्यूटेशन विकसित करना शुरू कर दिया था लेकिन वे अभी तक दवा के प्रति पूरी तरह से प्रतिरोधी नहीं हुए थे। शोधकर्ताओं ने स्पष्ट किया कि यह कोई गलती नहीं है, बल्कि एक विशेषता (feature) है। ई. कोली के मामले में, परीक्षण ने पांच बैक्टीरिया को फ्लैग किया जो फेनोटाइपिकली (phenotypically) दवा के प्रति संवेदनशील थे; हालाँकि, जेनेटिक सीक्वेंसिंग ने पुष्टि की कि इन पांच आइसोलेट्स में एक विशिष्ट "प्रथम-चरण" म्यूटेशन (S83L) था जो पूर्ण प्रतिरोध विकसित करने का प्रारंभिक चरण है। हालांकि ये बैक्टीरिया लैब में प्रतिरोधी नहीं थे, लेकिन उनमें वह जेनेटिक परिवर्तन मौजूद था जो पूर्ण प्रतिरोध से पहले आता है। शोधकर्ताओं ने उल्लेख किया कि यह पारंपरिक अर्थों में 'फॉल्स पॉजिटिव' (false positive) नहीं है, बल्कि एक "प्री-रेसिस्टेंट" (pre-resistant) जीनोटाइप का पता लगाना है। यह डॉक्टरों के लिए अविश्वसनीय रूप से उपयोगी हो सकता है, जिससे उन्हें संक्रमण के कठिन होने से पहले ही उपचार बदलने की अनुमति मिल सकती है। महत्वपूर्ण रूप से, परीक्षण ने कभी भी किसी बैक्टीरिया को प्रतिरोधी के रूप में फ्लैग नहीं किया यदि उसमें प्रतिरोध से जुड़ा विशिष्ट जेनेटिक म्यूटेशन नहीं था; प्रत्येक पॉजिटिव सिग्नल एक वास्तविक जेनेटिक परिवर्तन के अनुरूप था, भले ही उस परिवर्तन के परिणामस्वरूप अभी पूर्ण दवा प्रतिरोध न हुआ हो।

पूरी प्रक्रिया अत्यंत सरल और तेज़ है। पारंपरिक जेनेटिक टेस्टिंग के विपरीत, जिसके लिए महंगे, भारी मशीनों की आवश्यकता होती है जो विभिन्न तापमानों के माध्यम से चक्र पूरा करती हैं, यह नई विधि एक ही स्थिर गर्म तापमान पर काम करती है। शोधकर्ता बैक्टीरिया से डीएनए को केवल पानी में उबालकर निकाल सकते थे, नमूने को अभिकर्मकों (reagents) के साथ मिला सकते थे, और प्रतीक्षा कर सकते थे। एक घंटे के भीतर, वे ट्यूब को यूवी लाइट के नीचे देख सकते थे। यदि बैक्टीरिया प्रतिरोधी थे, तो तरल चमकता था। यदि वे नहीं थे, तो यह काला रहता था। इस सरलता का अर्थ है कि इस परीक्षण का उपयोग अंततः छोटे क्लीनिकों या संसाधन-सीमित क्षेत्रों में भी किया जा सकता है जहाँ जटिल उपकरण उपलब्ध नहीं हैं।

यह अध्ययन दर्शाता है कि धीमी, कल्चर-आधारित टेस्टिंग से आगे बढ़ना और एंटीबायोटिक प्रतिरोध के जेनेटिक मूल का सीधे पता लगाना संभव है। एक तीव्र डीएनए कॉपी करने वाली विधि को एक सटीक जेनेटिक सर्च टूल के साथ जोड़कर, शोधकर्ताओं ने एक ऐसी प्रणाली बनाई है जो मूत्र मार्ग के सबसे सामान्य संक्रमणों के लिए तेज़ और सटीक है। हालांकि यह परीक्षण बैक्टीरिया के प्रतिरोणीय होने के हर एक संभव तरीके को नहीं पकड़ता है, लेकिन यह सबसे आम जेनेटिक कारणों के विशाल बहुमत की सफलतापूर्वक पहचान करता है। यह दृष्टिकोण तेज़, स्मार्ट उपचार निर्णयों की ओर एक आशाजनक मार्ग प्रदान करता है, जिससे यह सुनिश्चित करने में मदद मिलती है कि मरीजों को सही एंटीबायोटिक जल्दी मिले और दवा-प्रतिरोधी 'सुपरबग्स' के प्रसार को धीमा किया जा सके।