Recombinase Polymerase Amplification Coupled with CRISPR-Cas12a for Rapid Detection of Ciprofloxacin-Resistance Mutations in Clinical Urinary Isolates

Bacteriële infecties van de urinewegen behoren tot de meest voorkomende kwalen die wereldwijd in ziekenhuizen en klinieken worden behandeld. Hoewel veel gevallen vanzelf genezen of met eenvoudige zorg, vereisen anderen antibiotica om te voorkomen dat de infectie zich verspreidt. Decennialang hebben artsen vertrouwd op een klasse medicijnen genaamd fluoroquinolonen om deze infecties te behandelen, omdat ze goed werken en gemakkelijk in te nemen zijn. Echter, bacteriën zijn slim en aanpasbaar; in de loop der tijd hebben veel van hen geleerd deze medicijnen te negeren, waardoor ze nutteloos worden. Wanneer een patiënt wordt geïnfecteerd met een resistente stam, faalt de standaardbehandeling en kan de infectie gevaarlijk worden. De huidige manier om vast te stellen of een specifieke bacterie resistent is, houdt in dat het micro-organisme in een laboratoriumschaaltje wordt gekweekt en men observeert hoe het op het medicijn reageert. Dit proces is betrouwbaar maar traag, en duurt vaak één tot drie dagen voordat er een resultaat is. In die tijd kunnen patiënten de verkeerde medicatie krijgen, of kan de infectie verergeren. Wetenschappers zoeken al lang naar een snellere manier om resistentie te detecteren, een methode die direct naar de genetische code van de bacteriën kijkt om de specifieke veranderingen te vinden die hen immuun maken voor behandeling.

Een team van onderzoekers heeft een nieuwe methode ontwikkeld die twee krachtige biologische instrumenten combineert om dit probleem op te lossen. Het eerste instrument is een techniek die werkt als een moleculaire fotokopieermachine, in staat om miljoenen kopieën van een specifiek stukje bacterieel DNA te maken in één enkele stap, zonder de complexe verwarmings- en afkoelingscycli van traditionele machines nodig te hebben. Het tweede instrument is een systeem van moleculaire scharen, oorspronkelijk ontdekt als een bacteriële immuunverdediging, dat geprogrammeerd kan worden om te jagen op een zeer specifieke sequentie van genetische letters. Wanneer dit systeem zijn doelwit vindt, springt het open en knipt het een lichtgevend chemisch label door, waardoor een signaal ontstaat dat met het blote oog zichtbaar is onder een eenvoudig ultraviolet licht. Door deze twee instrumenten aan elkaar te koppelen, creëerden de onderzoekers een test die de genetische mutaties die verantwoordelijk zijn voor ciprofloxacine-resistentie in slechts één uur kan identificeren.

De onderzoekers testten dit nieuwe systeem op 137 echte bacterie monsters verzameld van patiënten met urineweginfecties. Deze monsters kwamen van drie van de meest voorkomende typen bacteriën die deze infecties veroorzaken: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae en Proteus mirabilis. Voordat ze hun nieuwe methode testten, bracht het team eerst het genetische landschap van deze bacteriën in kaart met behulp van een gouden standaard sequencing-techniek. Ze ontdekten dat resistentie in deze bacteriën meestal voortkomt uit minuscule veranderingen in specifieke genen die de controle houden over hoe de bacteriën hun interne machinerie opbouwen. Bij E. coli omvatte het meest voorkomende resistentiepatroon twee specifieke veranderingen die samenwerkten, terwijl de veranderingen bij de andere twee soorten iets anders waren. Dit bevestigde dat een enkel testontwerp niet voor alle bacteriën zou werken; de test moest worden afgestemd op de specifieke genetische handtekening van elke soort.

Het team ontwierp vervolgens zeven unieke genetische "gidsen" om op deze specifieke mutaties te jagen. Elke gids werd geprogrammeerd om alleen de gemuteerde versie van het gen te herkennen dat resistentie veroorzaakt, waarbij de normale, gezonde versie wordt genegeerd. Toen ze hun nieuwe test uitvoerden op de 137 monsters, waren de resultaten opmerkelijk. Voor de E. coli-monsters identificeerde de test succesvol elk van de 18 bacteriën die bekend stonden als resistent tegen het medicijn, maar alleen wanneer de onderzoekers meerdere gidsen combineerden in een enkel paneel om naar de verschillende mogaanlijke resistentiemutaties te kijken. Dit gebeurde door te zoeken naar de bekende resistentiemutaties en deze te markeren. De test was ook zeer accuraat voor Proteus mirabilis, waarbij 95 procent van de resistente gevallen werd gedetecteerd. Voor Klebsiella pneumoniae vond de test 58 procent van de resistente gevallen. De onderzoekers merkten op dat de gemiste gevallen in deze groep waarschijnlijk te wijten waren aan een ander type resistentiemechanisme dat niet betrokken is bij de specifieke genen waar zij naar zochten, wat betekent dat de test niet perfect is voor elk type resistentie, maar zeer effectief is voor de meest voorkomende genetische oorzaken.

Een van de belangrijkste bevindingen was hoe de test omging met bacteriën die nog niet volledig resistent waren. De test markeerde soms bacteriën die begonnen waren een resistentiemutatie te ontwikkelen maar nog niet volledig resistent waren tegen het medicijn. De onderzoekers legden uit dat dit geen fout is, maar een kenmerk. In het geval van E. coli markeerde de test vijf bacteriën die fenotypisch gevoelig waren voor het medicijn; echter bevestigde genetische sequencing dat deze vijf isolaten een specifieke "eerste stap"-mutatie (S83L) droegen, die de beginfase is van het ontwikkelen van resistentie. Hoewel deze bacteriën in het laboratorium nog niet resistent waren, bezaten ze de genetische verandering die voorafgaat aan volledige resistentie. De onderzoekers merkten op dat dit geen vals positief resultaat is in de traditionele zin, maar eerder de detectie van een "pre-resistente" genotype. Dit zou ongelooflijk nuttig kunnen zijn voor artsen, waardoor zij behandelingen vroegtijdig kunnen aanpassen voordat de infectie moeilijker te behandelen wordt. Cruciaal was dat de test nooit een bacterie als resistent markeerde als deze de specifieke genetische mutatie die met resistentie geassocieerd wordt, miste; elk positief signaal kwam overeen met een echte genetische verandering, zelfs als die verandering nog niet had geleid tot volledige drugresistentie.

Het hele proces is opmerkelijk eenvoudig en snel. In tegenstelling tot traditionele genetische tests, die dure, logge machines vereisen die door verschillende temperaturen cyclen, werkt deze nieuwe methode op één constante warme temperatuur. De onderzoekers konden het DNA uit de bacteriën extraheren door ze simpelweg in water te koken, het monster met de reagentia te mengen en te wachten. Binnen een uur konden ze de buis onder een UV-licht bekijken. Als de bacteriën resistent waren, zou de vloeistof oplichten. Als ze dat niet waren, zou het donker blijven. Deze eenvoud betekent dat de test uiteindelijk gebruikt kan worden in kleinere klinieken of omgevingen met beperkte middelen waar complexe apparatuur niet beschikbaar is.

De studie toont aan dat het mogelijk is om verder te gaan dan trage, op cultuur gebaseerde tests en direct de genetische wortels van antibioticaresistentie te detecteren in een fractie van de tijd. Door een snelle DNA-kopieermethode te combineren met een nauwkeurig genetisch zoekinstrument, hebben de onderzoekers een systeem gecreëerd dat zowel snel als accuraat is voor de meest voorkomende typen urineweginfecties. Hoewel de test niet elke mogelijke manier vangt waarop bacteriën resistent kunnen worden, identificeert hij succesvol het overgrote deel van de meest voorkomende genetische oorzaken. Deze aanpak biedt een veelbelovend pad naar snellere, intelligentere behandelbeslissingen, wat helpt om ervoor te zorgen dat patiënten sneller het juiste antibioticum krijgen en de verspreiding van medicijnresistente superbugs te vertragen.