Optimization of carotenoid production by Rhodotorula mucilaginosa using sugarcane bagasse hydrolysate as carbon source and mutagen ethyl methanesulfonate for biosynthesis of antioxidant

في عالم الغذاء والدواء، توفر الطبيعة لوحة نابضة بالحياة من الأصباغ التي تفعل ما هو أكثر من مجرد تلوين عالمنا؛ إنها تحميه. ومن بين هذه الأصباغ الكاروتينات، وهي عائلة من المركبات المضادة للأكسدة الموجودة في الجزر والطماطم والعديد من النباتات الأخرى. تعمل هذه الجزيئات كدرع للخلايا الحية، حيث تعادل المواد الضارة التي يمكن أن تسبب تلفاً للأنسجة وتساهم في الأمراض المزمنة. وعلى مدى عقود، سعى العلماء لإيجاد طرق لإنتاج هذه المركبات القيمة دون الاعتماد فقط على حصاد المحاصيل، الذي يمكن أن يكون موسمياً ويستهلك مساحات واسعة من الأراضي. وبدلاً من ذلك، توجهوا إلى العالم المجهري، مستخدمين كائنات دقيقة مثل الخميرة والبكتيريا كمصانع حية. يمكن تغذية هذه الميكروبات بالسكريات البسيطة وحثها على إنتاج الكاروتينات بكميات كبيرة، مما يوفر بديلاً مستداماً لا يتنافس مع الإمدادات الغذائية. ومع ذلك، يكمن التحدي في إيجاد مصدر غذاء رخيص ووفير لهذه الميكروبات، ثم تدريبها على العمل بجدية أكبر، لإنتاج صبغة أكثر مما يمكن لنظائرها الطبيعية إنتاجه على الإطلاق.

لقد اتخذ فريق من الباحثين في إندونيسيا خطوة كبيرة للأمام في هذا المسعى من خلال تحويل النفايات الزراعية إلى منتج عالي القيمة. فقد ركزوا على تفل قصب السكر (bagasse)، وهو البقايا الليفية المتبقية بعد عصر عصير قصب السكر. هذه المادة وفيرة، حيث يتم إنتاج مئات الملايين من الأطنان منها عالمياً كل عام، ومع ذلك غالباً ما يتم استغلالها بشكل غير كافٍ. أدرك الباحثون أن التفل غني بالسليلوز، وهو سكر معقد يمكن تكسيره إلى سكريات بسيطة مثل الجلوكوز الذي تعشقه الخميرة. كان هدفهم هو تحويل هذه النفايات إلى وسط نمو لخميرة Rhodotorula mucilaginosa، وهي نوع من الخميرة الحمراء المعروف بقدرتها على إنتاج الكاروتينات. ولجعل العملية أكثر كفاءة، لم يعتمدوا فقط على الخميرة الطبيعية، بل استخدموا أداة كيميائية لإنشاء طفرة "الخميرة الفائقة" التي تنتج صبغة أكثر بكثير من السلالة الأصلية.

بدأت الرحلة بتحضير نفايات قصب السكر. أخذ الباحثون تفل قصب السكر المجفف وعالجوه بمحلول قلوي خفيف لتفكيك بنيته القوية، مما يسهل عملية تكسيره. ثم أضافوا إنزيماً محدداً، وهو السليولاز، الذي يعمل مثل مقص جزيئي، حيث يقطع سلاسل السليلوز الطويلة إلى سكريات الجلوكوز والكسيلوز البسيطة التي تحتاجها الخميرة للبقاء على قيد الحياة. ومن خلال الاختبار الدقيق لتركيزات كيميائية مختلفة، حددوا الوصفة المثالية: معالجة بـ 0.75 مولار من هيدروكسيد الصوديوم متبوعة بالتحلل المائي باستخدام 20 جراماً من الإنزيم لكل لتر. أنتج هذا المزيج سائلاً غنياً بالسكريات القابلة للتخمر، يحتوي على ما يقرب من 27.34 جراماً من الجلوكوز و3.59 جراماً من الكسيلوز لكل لتر. أصبح هذا المرق السكري موطناً جديداً للخميرة، ليحل محل السكريات المكررة باهظة الثمن ببديل متجدد ومنخفض التكلفة.

ومع جاهزية المصدر الغذائي، وجه الباحثون اهتمامهم نحو تحسين الخميرة نفسها. كانوا يعلمون أن السلالة الطبيعية من Rhodotorula mucilaginosa كانت قادرة، لكنهم أرادوا دفع حدود قدراتها. وللقيام بذلك، عرضوا خلايا الخميرة لـ "إيثيل ميثان سلفونات"، وهو مادة مطفرة كيميائية تُدخل تغييرات عشوائية صغيرة على الشفرة الوراثية للكائن الحي. فكر في هذه العملية كأنها إعادة خلط أوراق اللعب في دليل تعليمات الخميرة؛ معظم عمليات الخلط تؤدي إلى عدم حدوث تغيير أو الحصول على يد خاسرة، ولكن في بعض الأحيان، ينتج عن الخلط مجموعة رابحة. لقد اختبروا تركيزات مختلفة من المادة الكيميائية، ووجدوا أن محلول بنسبة 4 بالمائة هو النقطة المثالية؛ فقد كان قوياً بما يكفي للقضاء على الغالبية العظمى من الخلايا — حوالي 97.6 بالمائة — مما يضمن بقاء المستعمرات الأكثر قوة فقط، ولكنه كان لطيفاً بما يكفي لترك بعض المستعمرات القابلة للحياة التي خضعت لتغييرات وراثية مفيدة.

من بين الناجين من هذا التحدي الكيميائي، اختار الباحثون سبع مستعمرات متميزة لمعرفة أي منها قد تحسن أكثر. قاموا بتنمية كل منها في مرق مغذٍ قياسي وقاسوا كمية الكاروتينات التي تنتجها. وبينما أظهرت عدة طفرات نتائج واعدة، برزت سلالة واحدة، أُطلق عليها اسم M7، بفضل اتساقها وإنتاجها العالي. وعندما قارن الفريق بين هذه الطفرة والخميرة الأصلية غير المعدلة، كان الفرق صارخاً. أنتجت الطفرة M7 33.12 ميكروغرام من الكاروتينات لكل جرام من الكتلة الحيوية للخميرة الجافة، وهي زيادة بمقدار 1.46 ضعف مقارنة بالسلالة الأصلية التي أنتجت 22.64 ميكروغرام فقط لكل جرام. لم يكن هذا التحسن مجرد مسألة امتلاك المزيد من الصبغة داخل الخلايا؛ بل إن الطفرة قامت أيضاً بتحويل السكر الموجود في مرق التفل إلى كاروتينات بكفاءة أكبر. فمقابل كل جرام من الجلوكوز المستهلك، أنتجت الطفرة 5.15 ميكروغرام من الكاروتينات، بينما أنتجت السلالة الأصلية أقل من نصف ذلك الكم.

امتد أداء الطفرة ليشمل حجم الإنتاج الإجمالي أيضاً. ففي نفس الفترة الزمنية، ولدت سلالة M7 تركيزاً إجمالياً من الكاروتينات بلغ 66.80 ميكروغرام لكل لتر من السائل، وهو ما يقرب من ضعف الـ 33.51 ميكروغرام التي أنتجتها السلالة الأصلية. ترجم هذا إلى سرعة إنتاج تبلغ ضعف السرعة، حيث أنتجت الطفرة 0.46 ميكروغرام من الكاروتينات لكل لتر كل ساعة، مقارنة بـ 0.23 للسلالة الأصلية. وبعيداً عن الأرقام، لاحظ الباحثون أن الطفرة كانت أكثر تكيفاً مع بيئة قصب السكر. فبينما استغرقت الخميرة الأصلية ست ساعات للتكيف مع المرق الجديد قبل أن تبدأ في النمو، بدأت الطفرة M7 في التكاثر فوراً، مما يشير إلى أن التغييرات الوراثية جعلتها أكثر مرونة وجاهزية للعمل.

أخيراً، اختبر الفريق ما إذا كانت هذه الزيادة في الإنتاج تؤدي بالفعل إلى مضاد أكسدة أقوى. استخدموا اختباراً قياسياً يقيس مدى قدرة المادة على تحييد الجذور الحرة، وهي وظيفة رئيسية لمضادات الأكسدة. أظهر المستخلص من الطفرة M7 نشاطاً في كنس الجذور الحرة بنسبة 46.94 بالمائة، وهو أعلى من نسبة 35.75 بالمائة التي سجلتها السلالة الأصلية. ومع ذلك، كشف التحليل الإحصائي أن هذا الفرق لم يكن كبيراً بما يكفي لاعتباره تحسناً حاسماً فوق السلالة الأصلية. يشير هذا إلى أنه بينما أنتجت الطفرة كمية أكبر من الكاروتينات بشكل عام، فإن المزيج المحدد من الأصباغ التي صنعتها قد يكون قد تغير. تنتج الخميرة أنواعاً عدة من الكاروتينات، بما في ذلك بيتا كاروتين، وتورولين، وتورولورودين، والتي تمتلك قدرات مختلفة كمضادات للأكسدة. ومن الممكن أن تكون الطفرة قد أنتجت نوعاً أقل قوة في هذا الاختبار المحدد، أو أن الزيادة الإجمالية في الصبغة لم تكن كافية لإظهار فرق إحصائي واضح في هذا الاختبار.

تخلص الدراسة إلى أن الجمع بين النفايات الزراعية والتحسين الوراثي يمثل مساراً قابلاً للتطبيق نحو إنتاج مستدام للكاروتينات. فمن خلال استخدام تفل قصب السكر، أثبت الباحثون أن السكريات الغالية المخصصة للاستهلاك الغذائي ليست ضرورية لتغذية هذه المصانع الميكروبية. وباستخدام الطفرات الكيميائية، أظهروا أن سلالات الخميرة الطبيعية يمكن تعزيزها للعمل بجهد وكفاءة أكبر. وبينما تتطلب قوة مضادات الأكسدة في المنتج النهائي دراسة أكثر تفصيلاً لفهم أنواع الأصباغ الموجودة بالضبط، فإن العملية نفسها تقدم إطاراً واعداً. إنها تحول منتجاً مهملًا إلى مورد قيم وتخلق كائناً أكثر إنتاجية، مما يشير إلى مستقبل يمكن فيه إنتاج الأصباغ الطبيعية بتكلفة منخفضة واستدامة دون الضغط على الأنظمة الغذائية لكوكبنا.