Optimization of carotenoid production by Rhodotorula mucilaginosa using sugarcane bagasse hydrolysate as carbon source and mutagen ethyl methanesulfonate for biosynthesis of antioxidant

In de wereld van voedsel en medicijnen biedt de natuur een levendig palet aan pigmenten die meer doen dan alleen onze wereld inkleuren; ze beschermen deze ook. Hieronder vallen carotenoïden, een familie van antioxidante verbindingen die te vinden zijn in wortelen, tomaten en veel andere planten. Deze moleculen fungeren als een schild voor levende cellen, waarbij ze schadelijke stoffen neutraliseren die weefsels kunnen beschadigen en kunnen bijdragen aan chronische ziekten. Decennialang hebben wetenschappers gezocht naar manieren om deze waardevolle verbindingen te produceren zonder uitsluitend afhankelijk te zijn van het oogsten van gewassen, wat seizoensgebonden en landintensief kan zijn. In plaats daarvan hebben ze zich gericht op de microscopische wereld, waarbij ze minuscule organismen zoals gist en bacteriën gebruiken als levende fabrieken. Deze microben kunnen worden gevoed met eenvoudige suikers en worden uitgedaagd om carotenoïden in grote hoeveelheden te produceren, wat een duurzaam alternatief biedt dat niet concurreert met voedselvoorraden. De uitdaging ligt echter in het vinden van een goedkope en overvloedige voedselbron voor deze microben en het vervolgens trainen om harder te werken, waardoor ze meer pigment produceren dan hun natuurlijke tegenhangers ooit zouden kunnen.

Een team onderzoekers in Indonesië heeft een belangrijke stap voorwaarts gezet in deze inspanning door landbouwafval om te zetten in een hoogwaardig product. Ze richtten zich op suikerrietbagasse, het vezelrijke residu dat overblijft nadat het suikerrietsap eruit is geperst. Dit materiaal is overvloedig aanwezig, met honderden miljoenen tonnen die wereldwijd elk jaar worden geproduceerd, maar het wordt vaak onderbenut. De onderzoekers wisten dat bagasse rijk is aan cellulose, een complexe suiker die kan worden afgebroken tot eenvoudige suikers zoals glucose, waar gist dol op is. Hun doel was om dit afval te transformeren tot een groeimedium voor Rhodotorula mucilaginosa, een rode gist die bekend staat om haar vermogen om carotenoïden te produceren. Om het proces nog efficiënter te maken, vertrouwden ze niet alleen op de natuurlijke gist; ze gebruikten een chemisch hulpmiddel om een "supergist"-mutant te creëren die veel meer pigment produceert dan de oorspronkelijke stam.

De reis begon met de voorbereiding van het suikerrietafval. De onderzoekers namen de gedroogde bagasse en behandelden deze met een milde alkalische oplossing om de taai structuur te versoepelen, waardoor het makkelijker af te breken was. Vervolgens voegden ze een specifiek enzym toe, cellulase, dat werkt als een paar moleculaire scharen, die de lange celluloseketens doorsnijdt in de eenvoudige glucose- en xylose-suikers die de gist nodig heeft om te overleven. Door zorgvuldige testen van verschillende chemische concentraties identificeerden zij het perfecte recept: een behandeling met 0,75 molair natriumhydroxide gevolgd door hydrolyse met 20 gram enzym per liter. Deze combinatie leverde een vloeistof op die rijk is aan fermenteerbare suikers, met ongeveer 27,34 gram glucose en 3,59 gram xylose per liter. Deze suikerrijke bouillon werd de nieuwe thuisbasis voor de gist, waarbij dure, geraffineerde suikers werden vervangen door een hernieuwbaar, goedkoop alternatief.

Met de voedselbron gereed, richtten de onderzoekers hun aandacht op het verbeteren van de gist zelf. Ze wisten dat de natuurlijke stam van Rhodotorula mucilaginosa in staat was, maar ze wilden de grenzen ervan verleggen. Om dit te doen, stelden ze de gistcellen bloot aan ethylmethanesulfonaat, een chemische mutagen die kleine, willekeurige veranderingen in de genetische code van het organisme aanbrengt. Denk bij dit proces aan het schudden van het kaartspel in de instructiehandleiding van de gist; de meeste schudbeurten resulteren in geen verandering of een slechte hand, maar af en toe creëert een schudbeurt een winnende combinatie. Ze testten verschillende concentraties van de chemische stof en vonden dat een oplossing van 4 procent het ideale punt was. Het was sterk genoeg om het overgrote deel van de cellen — ongeveer 97,6 procent — te doden, waardoor alleen de meest robuuste overlevers overbleven, maar zacht genoeg om een paar levensvatbare kolonies achter te laten die gunstige genetische veranderingen hadden ondergaan.

Vanuit de overlevers van deze chemische uitdaging selecteerden de onderzoekers zeven verschillende kolonies om te zien welke het meest verbeterd was. Ze kweekten elke kolonie in een standaard voedingsbodem en maten hoeveel carotenoïde zij produceerden. Hoewel verschillende mutanten veelbelovend waren, viel één stam, aangeduid als M7, op vanwege haar consistentie en hoge output. Toen het team deze mutant vergeleek met de oorspronkelijke, ongewijzigde gist, was het verschil opvallend. De M7-mutant produceerde 33,12 microgram carotenoïde voor elke gram droge gistbiomassa, een 1,46-voudige toename ten opzichte van de inheemse stam, die slechts 22,64 microgram per gram produceerde. Deze verbetering was niet alleen een kwestie van meer pigment in de cellen hebben; de mutant kon de suiker in de bagasse-broth ook veel efficiënter omzetten in carotenoïde. Voor elke gram geconsumeerde glucose leverde de mutant 5,15 microgram caroteenide op, terwijl de inheemse stam minder dan de helft daarvan opleverde.

De prestaties van de mutant strekten zich ook uit tot het totale volume van de productie. In dezelfde tijd genereerde de M7-stam een totale carotenoïdeconcentratie van 66,80 microgram per liter vloeistof, bijna het dubbele van de 33,51 microgram die door de inheemse stam werd geproduceerd. Dit vertaalde zich naar een productiesnelheid die twee keer zo snel was, waarbij de mutant 0,46 microgram carotenoïde per liter per uur creëerde, vergeleken met 0,23 voor de oorspronkelijke stam. Naast de cijfers observeerden de onderzoekers dat de mutant beter aangepast was aan de suikerrietomgeving. Terwijl de inheemse gist zes uur nodig had om te wennen aan de nieuwe bouillon voordat zij begon te groeien, begon de M7-mutant onmiddellijk te vermenigvuldigen, wat suggereert dat de genetische veranderingen haar veerkrachtiger en klaar voor werk hadden gemaakt.

Ten slotte testten de onderzoekers of deze verhoogde productie daadwerkelijk resulteerde in een krachtiger antioxidant. Ze gebruikten een standaardtest die meet hoe goed een stof vrije radicalen kan neutraliseren, een kernfunctie van antioxidanten. Het extract van de M7-mutant vertoonde een radicalen wegvangsactiviteit van 46,94 procent, hoger dan de 35,75 procent van de inheemse stam. Echter, de statistische analyse onthulde dat dit verschil niet significant genoeg was om als een definitieve verbetering ten opzichte van de oorspronkelijke stam te worden beschouwd. Dit suggereert dat hoewel de mutant meer carotenoïde produceerde, de specifieke mix van pigmenten die zij creëerde, mogelijk verschoven was. De gist produceert verschillende soorten carotenoïden, waaronder bèta-caroteen, toruleen en torularhodine, die verschillende sterktes als antioxidanten hebben. Het is mogelijk dat de mutant meer van een type produceerde dat minder krachtig is in deze specifieke test, of dat de totale toename in pigment simpelweg niet genoeg was om een duidelijk statistisch verschil te tonen in deze assay.

De studie concludeert dat het combineren van landbouwafval met genetische verbetering een levensvatbaar pad is naar duurzame carotenoïdproductie. Door suikerrietbagasse te gebruiken, hebben de onderzoekers aangetoond dat dure voedingswaardige suikers niet nodig zijn om deze microbiële fabrieken aan te drijven. Door chemische mutagenese te gebruiken, hebben ze laten zien dat natuurlijke gisten stammen kunnen worden verbeterd om harder en efficiënter te werken. Hoewel de antioxidantkracht van het eindproduct verdere gedetailleerde studie vereist om precies te begrijpen welke pigmenten aanwezig zijn, biedt het proces zelf een veelbelovend kader. Het verandert een afvalproduct in een waardevol hulpbron en creëert een productiever organisme, wat wijst op een toekomst waarin natuurlijke pigmenten goedkoop en duurzaam kunnen worden gemaakt zonder de voedselvoorziening van de planeet te belasten.