Optimization of carotenoid production by Rhodotorula mucilaginosa using sugarcane bagasse hydrolysate as carbon source and mutagen ethyl methanesulfonate for biosynthesis of antioxidant

Nel mondo del cibo e della medicina, la natura fornisce una vibrante tavolozza di pigmenti che fanno molto più che colorare il nostro mondo; essi lo proteggono. Tra questi ci sono i carotenoidi, una famiglia di composti antiossidanti presenti nelle carote, nei pomodori e in molte altre piante. Queste molecole agiscono come uno scudo per le cellule viventi, neutralizzando le sostanze nocive che possono danneggiare i tessuti e contribuire alle malattie croniche. Per decenni, gli scienziati hanno cercato modi per produrre questi preziosi composti senza fare affidamento esclusivamente sul raccolto delle colture, che può essere stagionale e intensivo in termini di suolo. Inveve, si sono rivolti al mondo microscopico, utilizzando piccoli organismi come lieviti e batteri come fabbriche viventi. Questi microbi possono essere nutriti con zuccheri semplici e indotti a produrre carotenoidi in grandi quantità, offrendo un'alternza sostenibile che non compete con le scorte alimentari. La sfida, tuttavia, risiede nel trovare una fonte di cibo economica e abbondante per questi microbi e poi nell'addestrarli a lavorare più duramente, producendo più pigmento di quanto i loro corrispettivi naturali possano mai fare.

Un team di ricercatori in Indonesia ha compiuto un passo significativo in questo sforzo trasformando i rifiuti agricoli in un prodotto ad alto valore. Si sono concentrati sulla bagassa di canna da zucchero, il residuo fibroso che rimane dopo che il succo della canna è stato estratto. Questo materiale è abbondante, con centinaia di milioni di tonnellate prodotte globalmente ogni anno, eppure è spesso sottoutilizzato. I ricercatori sapevano che la bagassa è ricca di cellulosa, uno zucchero complesso che può essere scomposto in zuccheri semplici come il glucosio, che il lievito ama mangiare. Il loro obiettivo era trasformare questo scarto in un terreno di coltura per Rhodotorula mucilaginosa, un lievito rosso noto per la sua capacità di produrre carotenoidi. Per rendere il processo ancora più efficiente, non si sono limitati a fare affidamento sul lievito naturale; hanno utilizzato uno strumento chimico per creare un "super-lievito" mutante che produce molto più pigmento rispetto al ceppo originale.

Il viaggio è iniziato con la preparazione dello scarto di canna da zucchero. I ricercatori hanno preso la bagassa essiccata e l'hanno trattata con una soluzione alcalina blanda per allentare la sua struttura tenace, rendendola più facile da scomporre. Hanno poi aggiunto un enzima specifico, la cellulasi, che agisce come un paio di forbici molecolari, tagliando le lunghe catene di cellulosa nei semplici zuccheri di glucosio e xilosio di cui il lievito ha bisogno per sopravvivere. Attraverso test accurati di diverse concentrazioni chimiche, hanno identificato la ricetta perfetta: un trattamento con 0,75 molar di idrossido di sodio seguito da idrolisi con 20 grammi di enzima per litro. Questa combinazione ha prodotto un liquido ricco di zuccheri fermentabili, contenente circa 27,34 grammi di glucosio e 3,59 grammi di xilosio per litro. Questo brodo zuccherino è diventato la nuova casa per il lievito, sostituendo gli zuccheri raffinati ed costosi con un'alternativa rinnovabile e a basso costo.

Con la fonte di cibo pronta, i ricercatori hanno rivolto la loro attenzione al miglioramento del lievito stesso. Sapevano che il ceppo naturale di Rhodotorula mucilaginosa era capace, ma volevano spingere i suoi limiti. Per farlo, hanno esposto le cellule di lievito all'etilsulfonato di etile, un mutageno chimico che introduce piccoli cambiamenti casuali nel codice genetico dell'organismo. Pensate a questo processo come a un rimescolamento del mazzo di carte nel manuale di istruzioni del lievito; la maggior parte dei rimescolamenti non produce alcun cambiamento o una mano persa, ma occasionalmente, un rimescolamento crea una combinazione vincente. Hanno testato varie concentrazioni del prodotto chimico, trovando che una soluzione al 4 percento era il punto ideale. Era abbastanza forte da uccidere la stragrande maggioranza delle cellule — circa il 97,6 percento — assicurando che rimanessero solo i sopravvissuti più robusti, ma abbastanza delicata da lasciare alcune colonie vitali che avevano subito cambiamenti genetici benefici.

Dai sopravvissuti a questa sfida chimica, i ricercatori hanno selezionato sette colonie distinte per vedere quale fosse quella che era migliorata di più. Hanno fatto crescere ciascuna in un brodo nutritivo standard e hanno misurato quanto carotenoide produceva. Sebbene diversi mutanti mostrassero potenziale, un ceppo, designato M7, si è distinto per la sua costanza e l'alto output. Quando il team ha confrontato questo mutante con il lievito originale, non modificato, la differenza è stata sorprendente. Il mutante M7 produceva 33,12 microgrammi di carotenoide per ogni grammo di biomassa secca di lievito, un aumento di 1,46 volte rispetto al ceppo nativo, che produceva solo 22,64 microgrammi per grammo. Questo miglioramento non era solo una questione di avere più pigmento all'interno delle cellule; il mutante convertiva anche lo zucchero nel brodo di bagassa in carotenoide in modo molto più efficiente. Per ogni grammo di glucosio consumato, il mutante produceva 5,15 microgrammi di carotenoide, mentre il ceppo nativo ne produceva meno della metà.

Le prestazioni del mutante si estendevano anche al volume complessivo di produzione. Nello stesso intervallo di tempo, il ceppo M7 ha generato una concentrazione totale di carotenoide di 66,80 microgrammi per litro di liquido, quasi il doppio dei 33,51 microgrammi prodotti dal ceppo nativo. Ciò si è tradotto in una velocità di produzione due volte superiore, con il mutante che creava 0,46 microgrammi di carotenoide per litro ogni ora, rispetto allo 0,23 dell'originale. Oltre ai numeri, i ricercatori hanno osservato che il mutante era meglio adattato all'ambiente della canna da zucchero. Mentre il lievito nativo impiegava sei ore per adattarsi al nuovo brodo prima di iniziare a crescere, il mutante M7 ha iniziato a moltiplicarsi immediatamente, suggerendo che i cambiamenti genetici lo avessero reso più resiliente e pronto a lavorare.

Infine, il team ha testato se questo aumento di produzione portasse effettivamente a un potere antiossidante maggiore. Hanno utilizzato un test standard che misura quanto bene una sostanza riesca a neutralizzare i radicali liberi, una funzione chiave degli antiossidanti. L'estratto del mutante M7 ha mostrato un'attività di scavenging dei radicali del 46,94 percento, superiore al 35,75 percento osservato nel ceppo nativo. Tuttavia, l'analisi statistica ha rivelato che questa differenza non era abbastanza significativa da essere considerata un miglioramento definitivo rispetto all'originale. Ciò suggerisce che, sebbene il mutante producesse più carotenoide in termini assoluti, la miscela specifica di pigmenti creati potrebbe essersi spostata. Il lievito produce diversi tipi di carotenoidi, tra cui beta-carotene, torulene e torularodina, che hanno diverse intensità come antiossidanti. È possibile che il mutante abbia prodotto un tipo meno potente in questo specifico test, o che l'aumento totale del pigmento non sia stato sufficiente per mostrare una chiara differenza statistica in questo saggio.

Lo studio conclude che combinare i rifiuti agricoli con il miglioramento genetico è una via percorribile verso la produzione sostenibile di carotenoidi. Utilizzando la bagassa di canna da zucchero, i ricercatori hanno dimostrato che non sono necessari zuccheri costosi di grado alimentare per alimentare queste fabbriche microbiche. Utilizzando la mutagenesi chimica, hanno dimostato che i ceppi naturali di lievito possono essere potenziati per lavorare più duramente e in modo più efficiente. Sebbene il potere antiossidante del prodotto finale richieda ulteriori studi dettagliati per comprendere esattamente quali pigmenti siano presenti, il processo stesso offre un quadro promettente. Trasforma un prodotto di scarto in una risorsa preziosa e crea un organismo più produttivo, puntando verso un futuro in cui i pigmenti naturali possano essere prodotti in modo economico e sostenibile senza gravare sui sistemi alimentari del pianeta.